Para começar, placa 3 vezes 10 elevado à potência de células de fibrossarcoma 6MCA205 em 10 mililitros de meio de crescimento completo em uma placa de Petri de 100 milímetros. Irradie as células com luz ultravioleta e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos seis horas para deixá-las morrer. Lave as células dendríticas diferenciadas in vitro, ou DCs, duas vezes, a 1100G por quatro minutos em um meio de crescimento completo.
Conte as DCs vazias derivadas da medula óssea usando o teste de exclusão do corante azul de Trypan. Centrifugue as células cancerígenas irradiadas a 1100G por cinco minutos. Defina a co-cultura de DCs vazias com células apoptóticas irradiadas em uma proporção de dois para um em uma placa de 12 poços por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, lave as células duas vezes a 1100G por cinco minutos em 10 mililitros de meio de crescimento completo em tubos de 15 mililitros. Para coloração da superfície celular, ressuspenda as DCs derivadas da medula óssea em 20 microlitros de tampão FACS frio e incube por 20 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Depois de lavar as células com tampão FACS, adicione 100 microlitros de PBS contendo corante infravermelho próximo fixável por 30 minutos.
Lave as células uma vez com PBS antes de ressuspendê-las no tampão FACS. Identifique as células de interesse com base em suas propriedades FSCA e SSCA. Em seguida, plote FSCA e FSCH para excluir dupletos e aglomerados de células da análise.
Plotar a área do filtro passa-banda de emissão de 780 a 60 nanômetros e SSCA para remover as células mortas. Usando filtros passa-banda de emissão de 575 a 26 e 530 a 30 nanômetros, detecte a positividade celular para o marcador CD11C e o ligante de células fluorescentes PKH67 em dois gráficos de densidade de parâmetros. Após a contagem, cultive as células T CD8 com DCs derivadas da medula óssea que absorveram células MCA205 apoptóticas em uma proporção de dois para cinco para um a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas.
Adicionar EdU ao meio de cocultura na concentração final de 10 micromolares e incubar durante 16 a 20 horas. Centrifugue o primer cruzado CD8 duas vezes a 1100G por cinco minutos e core para marcadores de superfície em tampão FACS frio por 20 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Depois de lavar as células duas vezes em tampão FACS, ressuspenda-as em 100 microlitros de PBS contendo o corante aqua fixável de vitalidade por 30 minutos.
Lave as suspensões celulares uma vez com três mililitros de 1% BSA em PBS em tubos de fluxo. Adicione 100 microlitros de paraformaldeído a 4% por 15 minutos para fixação celular. Incube as células em 100 microlitros de permeabilização à base de saponina e lave o reagente por 15 minutos.
Adicione 500 microlitros do coquetel de reação e incube por 30 minutos no escuro. Após a lavagem, ressuspenda as células em 100 microlitros de permeabilização à base de saponina e reagente de lavagem. Identifique as células de interesse com base em suas propriedades FSEA e SSEA.
Em seguida, plote FSEA e FSEH para excluir dublês e aglomerados de células da análise. Plotar 525 a 50 nanômetros de área de filtro passa-banda de emissão e SSCA para remover células mortas. Usando gráficos de densidade de filtro de passagem de banda de emissão de 530 a 30 e 575 a 26 nanômetros, detecte a positividade das células para CD8a e CD3.
Analise as células para incorporação de Alexa Fluor 647 EdU em um histograma de parâmetro único usando um filtro de emissão passa-banda de 660 a 620 nanômetros. As células dendríticas CD11c positivas engolfaram efetivamente as células cancerígenas MCA205 apoptóticas a 37 graus Celsius, demonstrando fagocitose dependente da temperatura nos estágios iniciais do ciclo de imunidade ao câncer. Após a fagocitose, as células dendríticas apresentaram níveis aumentados de CD86 e MHC-II, juntamente com níveis reduzidos de PDL1.
A expansão clonal de células T CD8 positivas, uma vez ativadas por células dendríticas maduras, foi evidente com aproximadamente 20% de taxa de proliferação. Usando modelos tumor-on-chip, foi observada a resposta quimiotática dessas células T às alarminas liberadas pelas células cancerígenas.
