Depois de recuperar CD8 cruzado de cocultura, centrifugue-os a 1100 g por 10 minutos em 10 mililitros de meio de crescimento completo. Ressuspenda 1 x 10 à potência de 7 células totais em 100 microlitros de microesferas de remoção de células mortas e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Coloque as colunas de separação no separador magnético e lave-as com tampão de ligação.
Transfira as suspensões de células para colunas de separação e colete o fluxo. Depois de lavar a coluna, colete as células não rotuladas que passam e combine-as com o fluxo coletado anteriormente. Centrifugar CD8 vivo enriquecido com escorva cruzada a 1100 g durante cinco minutos num meio de cultura completo.
Após a contagem, cultive células CD8 cruzadas com células MCA205 frescas em uma proporção de dois para um em placas de 12 poços e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Antes de recuperar o efetor CD8, adicione monensina e brefeldina às coculturas de células imunes cancerígenas por seis horas. Em seguida, recupere o efetor CD8 e centrifugue duas vezes a 1100 g por cinco minutos.
Ressuspenda as células em três misturas diferentes de anticorpos primários preparadas em tampão FACS frio e incube por 20 minutos a quatro graus Celsius, protegendo da luz. Adicione 100 microlitros de solução de fixação ao palato celular do Mix C e incube por 20 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Ressuspenda as células em um tampão de lavagem a frio e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Depois de lavar as células duas vezes em tampão FACS, adicione 100 microlitros de PBS contendo o Vitality Fixable Aqua Dye aos pellets celulares por 30 minutos. Identifique células de interesse com base em suas propriedades FSCA e SSCA. Em seguida, plote FSCA e FSCH para excluir dupletos e aglomerados de células da análise.
Plotar filtro passa-banda de emissão de 525/50 nanômetros e SSCA para remover células mortas, Usando filtros passa-banda de emissão de 660/20 e 780/60 nanômetros, detectar positividade celular para CDAA e CD3 em gráficos de densidade de dois parâmetros. Além disso, analise as células para marcadores CD44, CD25 e CD69 para o marcador CD137 e para interferon gama positivo e granzima B para Mix A, B e C, respectivamente. Para o ensaio de eliminação de tumores, complemente o meio de cocultura com um corante de quantificação de morte celular em tempo real.
Depois de aquecer a placa a 37 graus Celsius no sistema de análise de células vivas, execute a varredura de dados a cada duas horas por até 72 horas. Centrifugar as células duas vezes a 1000 g durante cinco minutos. Corar as células para marcadores de superfície com 20 microlitros de tampão FACS frio e incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius no escuro.
Em seguida, adicione o corante de vitalidade iodeto de propídio para corar as células para uma estratégia de gating. Identifique as células de interesse com base em suas propriedades FSCA e SSCA. Em seguida, plote FSCA e FSCH para excluir dupletos e aglomerados de células da análise.
Use um filtro passa-banda de emissão de 450/50 nanômetros para detectar células cancerígenas negativas para CD45. Em um histograma de parâmetro único, usando um filtro de emissão passa-banda de 610/620 nanômetros, analise as células quanto à incorporação de iodeto de propídio como intensidade fluorescente média. Por meio da citometria de fluxo multiparâmetro, os níveis de expressão superficial do marcador de ativação precoce CD69, marcadores de ativação tardia CD44 e CD25, expressão de membrana de CD137 e CD107, marcadores de reatividade tumoral foram aprimorados.
Os níveis intracelulares de moléculas citotóxicas, granzima B e interferon gama positiva foram progressiva e significativamente aumentados, atingindo um pico de expressão em 72 horas de cocultura. As células MCA205 cognatas cocultivadas sofreram níveis significativos de morte mediada por efetores CD8.
