Para começar, prepare seis meios de crescimento de nematóides ou placas de ágar NGM. No dia seguinte, adicione 200 microlitros de cultura de Escherichia coli OP50 nas placas e incube em temperatura ambiente por um dia. Após a incubação, adicione 200 microlitros de D-glicose 0,025 molar a quatro placas de ágar NGM e deixe-as secar à temperatura ambiente.
Transfira diferentes pedaços de Caenorhabditis elegans Bristol N2 de uma placa de ágar NGM de manutenção para uma nova placa NGM assentada com E.coli OP50. Incube os vermes C.elegans a 20 graus Celsius com umidade de mais de 95% por três dias. Três dias depois, adicione água destilada no prato e, usando uma pipeta Pasteur, colete as minhocas.
Transfira os vermes coletados para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e deixe-os sedimentar por gravidade antes de remover o sobrenadante do tubo. Em seguida, adicione água destilada no tubo. Quando o volume do tubo for reduzido para cinco mililitros, adicione 10 mililitros de solução clareadora e agite vigorosamente o tubo por aproximadamente seis minutos.
Em seguida, encher o tubo até uma capacidade de 50 mililitros com tampão M9 e centrifugar a 1400 g durante três minutos. Remova o sobrenadante até cinco mililitros e adicione 45 mililitros de tampão M9 no tubo. Após a última lavagem, retirar o sobrenadante até à marca de 15 mililitros e transferir o líquido restante para uma placa.
Observe a placa ao microscópio para a liberação de ovos e coloque a placa a 20 graus Celsius com umidade superior a 95% por 14 horas. Após a incubação, colete os vermes em um tubo de 15 mililitros. Usando uma pipeta automática, adicione 10 microlitros dos vermes sincronizados a uma lâmina de microscópio.
Conte o número de vermes e calcule o volume necessário para obter de 500 a 1000 vermes por microlitro. Transfira 500 a 1000 larvas de estágio um, ou L1, sincronizadas para as placas de ágar NGM. Previamente preparado e semeado com E.coli OP50 e glicose.
Incube a placa a 20 graus Celsius até que os vermes atinjam o estágio larval quatro, ou L4. Após 48 horas, adicione tampão M9 na placa e, usando uma pipeta Pasteur, colete as larvas L4. Transfira as larvas coletadas para um tubo de 1,5 mililitro. Projete o cronograma de ensaio para três grupos experimentais.
Transfira aproximadamente 100 microlitros de suspensão sem-fim de cada grupo para o microtubo de 1,5 mililitro contendo 400 microlitros de solução de iodo a 5% de Lugol. Agite suavemente o tubo em um misturador por cinco minutos. Depois de remover o tubo do misturador, espere que os vermes sedimentem por gravidade.
Lave as minhocas três vezes com um mililitro de tampão M9. Depois de ressuspender os vermes em 100 microlitros de tampão M9. Transfira aproximadamente 50 microlitros para a lâmina.
Coloque a lamínula na corrediça. Em seguida, em um microscópio estéreo, selecione o modo de campo claro e observe os vermes. Salve as imagens contendo um mínimo de 10 worms por grupo como um arquivo jpeg.
Finalmente, calcule o conteúdo de glicogênio com base na coloração de iodo dos vermes. Observações visuais do ensaio de conteúdo de glicogênio revelaram que os vermes em jejum exibiram uma coloração mais fraca em comparação com aqueles alimentados com E.coli OP50 e aqueles com E.coli OP50 e D-glicose, que exibiram a coloração mais intensa.
