Para obter a suspensão de célula única do cérebro do neurônio isolado, coloque o cérebro em um homogeneizador Dounce de vidro pré-resfriado de 15 mililitros contendo uma quantidade apropriada de solução salina balanceada de Hanks gelada, ou tampão HBSS. Use o pilão Dounce solto para dissociar suave e lentamente o tecido cerebral com cerca de 100 a 120 golpes no gelo. Filtre a suspensão de tecido cerebral resultante através de um filtro de células de 70 mícrons em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Enxágue o tubo Dounce com cinco mililitros de HBSS e prossiga com a filtração para maximizar a coleta de células. Centrifugar a suspensão de tecido filtrado a 550 g durante seis minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante usando um aspirador a vácuo e ressuspenda o palato celular em um mililitro de solução de gradiente de densidade isotônica a 30%.
Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Adicione uma quantidade apropriada de solução de gradiente de densidade de 30% e inverta suavemente o tubo para garantir uma mistura completa. Centrifugar imediatamente o tubo a 845 g com aceleração e travão regulados para o nível três durante 20 minutos a quatro graus Celsius.
Uma vez feito isso, remova suavemente o tubo da centrífuga sem agitar e aspire cuidadosamente a camada superior de mielina usando uma ponta de um mililitro conectada ao vácuo. Em seguida, aspire o sobrenadante, deixando um a dois mililitros para trás, e ressuspenda o palato celular com um mínimo de 10 mililitros de HBSS frio. Centrifugue a 550 g por seis minutos a quatro graus Celsius.
Lave mais uma vez com um mínimo de sete mililitros de HBSS frio e centrifugue novamente. Depois de remover o máximo possível do sobrenadante, ressuspenda as células em 100 a 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo para análise de citometria de fluxo.
