Para começar, prepare a solução de selenoproteína usando ensaio de mudança térmica ou tampão TSA. dispense a proteína, pequenas moléculas e o corante SYPRO Orange para os poços apropriados de uma placa de 384 poços. Cobrir a placa com uma película adesiva opticamente transparente e rodar brevemente a 1 000 g durante um minuto numa centrífuga.
Em seguida, coloque a placa em uma máquina de PCR em tempo real e programe-a para manter a amostra a 20 graus Celsius por dois minutos, seguida por um aumento de 0,5 grau na temperatura por minuto até 95 graus Celsius. Exporte os dados da máquina RT PCR para unidades de fluorescência relativa ou RFU em relação à temperatura. Usando o software de sua escolha, extraia e plote os pontos de dados até a intensidade mais alta medida para cada curva de fusão.
Determinar a temperatura de fusão com o ajuste sigmoidal de Boltzmann para os dados para determinar a temperatura de fusão ou Tm.As curvas de desnaturação térmica indicaram um aumento de quatro graus Celsius Escherichia na estabilidade térmica de Escherichia coli SelO na presença de ATP com íons de magnésio e um aumento de 12 graus Celsius no mesmo para ATP com íons manganês. No entanto, não houve mudança na estabilidade térmica após a incubação com UTP, indicando que Escherichia coli SelO pode não exibir ligação detectável ao UTP. Os controles sem proteína e sem corante apresentaram baixo sinal de fluorescência, que não respondeu ao aumento da temperatura.
