Para começar, pegue um prato de vidro com uma tampa bem ajustada. Coloque uma bola de algodão no prato. Sob um exaustor, adicione três a cinco mililitros de éter etílico à bola de algodão.
Cubra imediatamente o prato com a tampa. Use um pincel para pegar as larvas de terceiro ínstar de drosófila de frascos de mosca. Transfira uma larva para um recipiente pequeno e aberto.
Coloque o recipiente no prato de vidro com éter etílico e feche imediatamente o prato bem. Use um microscópio de dissecção para verificar a mobilidade da larva a cada 30 segundos. Transfira a larva anestesiada para uma lâmina de microscópio de vidro.
Mergulhe as larvas em uma gota de solução salina para insetos. Sob o microscópio de dissecação. Remova a maior parte da solução salina com um lenço de papel.
Posicione o lado dorsal da larva para cima para ablação de fibras gigantes ou o lado ventral para cima para ablação de TTMn. Em seguida, abaixe lentamente uma lama de cobertura de vidro sobre a larva. Adicione solução salina na lateral da lamínula.
Para preencher o espaço entre a lâmina de vidro e a lamínula. Para ablação de fibras gigantes, verifique o posicionamento do cérebro sob alta ampliação no microscópio de dissecação. Certifique-se de que o cérebro esteja nivelado e visível através da cutícula.
Para deslocar qualquer tecido adiposo que cubra o cérebro, use uma pinça para aplicar uma leve pressão na lamínula e mova a lamínula de um lado para o outro. Coloque a amostra em um estágio de microscópio multifóton. Use o filtro GFP para localizar a amostra no modo de epifluorescência.
Para ablação de fibras gigantes, concentre-se nas células de interesse e, em seguida, mude para o modo de dois fótons. Defina o laser para 870 nanômetros e ajuste o ganho do detector para visualizar as células que expressam GFP com o scanner Galvano, defina a área para ablação usando uma região circular de interesse. Em seguida, prossiga para configurar o protocolo de ablação no software, para isso, defina sequencialmente um quadro de aquisição, estimulação, seguido por outro quadro de aquisição.
Inicie a potência do laser de estimulação em um valor mais baixo e execute o protocolo de estimulação. Se a ablação não for bem-sucedida e apenas branquear a célula, aumente a potência do laser em incrementos de 5% ou o número de loops, um de cada vez, e execute o protocolo novamente. Faça isso até que a ablação celular bem-sucedida seja vista.
Depois de ablar a célula com sucesso, remova a lamínula. Com um pincel, pegue delicadamente as larvas da lâmina e transfira-as para um frasco de comida. Em amostras de ablação de fibras gigantes.
A ablação foi verificada através da ausência de um soma marcado com GFP no lado ablateado do cérebro. Para as larvas abladas TTMn. A ausência de TTMn em um lado foi facilmente reconhecida devido à falta de soma e dendritos.
