Para começar, obtenha a lâmina montada na amostra depois de envelhecê-la. Para pré-tratar a lâmina, mergulhe-a em série em frascos de coplin contendo soluções apropriadas pelo tempo especificado. Digerir o tecido com 100 a 200 microlitros de tampão de digestão da proteinase K e incubar à temperatura ambiente durante um minuto.
Para interromper a digestão, mergulhe imediatamente a lâmina em série em soluções de etanol por dois minutos cada. Aplique a mistura de hibridização FISH na lâmina e cubra a amostra com uma lamínula. Coloque as lâminas em uma placa quente, como um sistema de hibridização Slide Moat a 75 graus Celsius por dois a cinco minutos.
Em seguida, transfira a lâmina para outra placa quente ajustada a 37 graus Celsius para hibridizar durante a noite. Em seguida, mergulhe a corrediça no tampão de lavagem quente e remova cuidadosamente a lamínula. Lave e manche a lâmina usando reagentes apropriados no escuro.
Mergulhe rapidamente a lâmina em água deionizada por não mais de um segundo e coloque-a sobre uma toalha de papel. Após a secagem, monte o slide com mídia de montagem anti-desbotamento. Coloque a lamínula e sele-a com esmalte antes de fazer a imagem.
Usando uma lente de óleo 60X, capture o sinal fluorescente em várias pilhas Z. Por fim, execute uma projeção 3D máxima para obter a melhor resolução e aplique deconvolução ou outros algoritmos de limpeza de fundo. Nas amostras de câncer de mama triplo negativo, o FISH nuclear mostra principalmente dois pontos distintos por núcleo, representando seus dois sinais ERBB2.
Em contraste, as amostras positivas para HER2 exibem sinais FISH abundantes, indicando diferentes padrões de amplificação gênica. Além disso, alguns núcleos em amostras positivas para HER2 podem exibir clusters, sugestivos de hubs extras de DNA cromossômico, que são pontos focais para o aumento da amplificação gênica.
