Para começar, execute a reação em cadeia da polimerase, ou PCR, para amplificar a região desejada do DNA extraído do tecido. Traga a mistura mestre de enzimas de amplificação de sequenciamento, tampão e água bidestilada à temperatura ambiente e gire instantaneamente. Depois de preparar os tubos para sequenciamento, coloque o tubo de PCR no instrumento de PCR predefinido para amplificação.
Em seguida, retire o produto do instrumento de PCR e guarde os produtos da reação na geladeira, protegidos da luz. Vortex as contas magnéticas completamente. Adicione 10 microlitros de esferas magnéticas e 40 microlitros de etanol a 80% à placa de 96 poços e sele a placa com um filme.
Coloque a placa de 96 poços em um agitador de vórtice por 10 segundos para suspender e misturar totalmente as contas. Em seguida, prenda a placa com um elástico em um oscilador horizontal e vibre na configuração máxima por três a cinco minutos. Em seguida, coloque a placa PCR em um suporte magnético, certificando-se de que esteja firmemente pressionada.
Mantenha o suporte a quatro graus Celsius por três minutos para adsorção estática. Assim que as contas forem adsorvidas, remova o filme do teto e despeje o líquido residual. Enxágue as contas duas vezes com 40 microlitros de etanol a 80%.
Depois de despejar o líquido residual, coloque o prato em papel absorvente e seque-o suavemente. Coloque o papel absorvente com a placa magnética em uma centrífuga e gire a 120 g brevemente. Depois de retirar o álcool, leve o prato ao forno a 60 graus Celsius por três a cinco minutos para secar completamente as contas.
Em seguida, adicione 40 microlitros de água pura ao prato e sele-o com um filme. Agite-o em um agitador de vórtice por três a cinco segundos e coloque o prato em um agitador horizontal. Prenda-o e deixe a placa tremer por três a cinco minutos para dissolver o produto de sequenciamento purificado.
Por fim, girar o produto de sequenciamento dissolvido a 180 g e usar o produto para análise genômica usando eletroforese capilar. Este método pode detectar a mutação RHOA G17V conhecida e outras mutações de baixa frequência no intervalo de amplificação de primers a montante e a jusante. Mutações em dois genes adicionais, a saber, IDH2 e JAK1, também foram analisadas corretamente usando este método.
