Para começar, core as células murinas da medula óssea com Hoechst 33342. Para citometria de fluxo, inicie o software necessário e selecione a padronização de CQ. Insira o controle de qualidade ou QC FluoroSphere sample tubo no suporte do tubo antes de selecionar iniciar para iniciar o procedimento de CQ.
Para criar um novo experimento, clique em Novo experimento no menu Arquivo, especifique o caminho do arquivo e salve o experimento. Em seguida, selecione Definir canal no menu Configurações. Marque a caixa de seleção do sinal do canal e adicione o nome do reagente na coluna do rótulo.
Em seguida, clique no ícone de gráficos de pseudocores na área de plotagem para criar gráficos. Clique em adicionar tubo na tela do tubo de ensaio para criar novos tubos de amostra e alterar seus nomes. Em seguida, selecione Executar para carregar o exemplo, exibir os gráficos e estabelecer as portas.
Ajuste as configurações de ganho e limite e selecione Gravar para salvar os dados. Para projetar a lógica de configuração da porta, clique no eixo x para selecionar FSEW e clique no eixo y para selecionar FSEA. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta A para circundar a célula individual e excluir as células aderentes.
Para o segundo gráfico, clique no eixo x para selecionar FSA e clique no eixo y para selecionar SSEA. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta B para separar células não fragmentárias e excluir detritos celulares. Para o terceiro gráfico, clique no eixo x para selecionar PIA e clique no eixo y para selecionar SSEA.
Depois de desenhar a porta B, selecione células vivas exibindo iodeto de propídio negativo e desenhe a porta C para obter células vivas. Para o quarto gráfico bidimensional, clique no eixo x para selecionar Hoechst Red e clique no eixo y para selecionar Hoechst Blue. Clique com o botão direito do mouse na plotagem e selecione Propriedade no menu suspenso.
Selecione o formato linear para os eixos x e y e desenhe a porta para as células de população lateral. Use os lasers de 355 nanômetros e 405 nanômetros simultaneamente para detectar as células de controle e as células experimentais. Adquira sinais fluorescentes nos canais de 690 por 50 e 450 por 50 nanômetros correspondentes aos dois lasers.
Observe a estimulação eficaz do corante Hoechst 33342 com lasers de 355 e 405 nanômetros para visualizar as células da população do lado claro. Para as mesmas amostras, use os lasers de 375 nanômetros e 405 nanômetros para detecção de células. O laser de 355 nanômetros excitou efetivamente o corante Hoechst 33342, resultando em uma observação clara das células SP da medula óssea.
As células SP das mesmas amostras detectadas pelo laser de 355 nanômetros e pelo laser de 405 nanômetros foram consideradas essencialmente idênticas. Os lasers de 375 nanômetros e 405 nanômetros efetivamente excitaram o Hoechst 33342 para obter células SP.
