Para começar, prepare as misturas de soro e enzimas junto com seus respectivos controles. No leitor de microplacas, configure um protocolo de leitura cinética para medir a absorbância a 260 nanômetros com o intervalo de leitura mais curto por 30 minutos. Em seguida, descongele todas as amostras congeladas no gelo e dilua cada amostra descongelada de 1 a 10 com 1x PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius em tubos de microcentrífuga LoBind.
Para preparar um estoque de adenosina de cinco milimolares, adicione 66,8 miligramas de adenosina a 50 mililitros de 1x PBS. Depois de diluí-lo em uma solução micromolar de 250, pré-aqueça a adenosina a 37 graus Celsius em uma incubadora. Em uma microplaca compatível com ultravioleta de 96 poços, adicione 160 microlitros de adenosina seguidos por 40 microlitros de cada amostra de proteína diluída em triplicatas.
Meça a absorbância de cada poço a 260 nanômetros por 30 minutos a 37 graus Celsius. Para análise de dados, exporte os dados para uma planilha e, em seguida, determine a inclinação da região linear dos dados de absorbância em função do tempo para os primeiros minutos. Subtrair a inclinação do controlo negativo que consiste em soro humano agrupado ou PBS das inclinações das misturas de enzimas mais soro e das misturas de enzimas mais PBS, respectivamente.
Por fim, normalize todas as inclinações ajustadas para a inclinação original no ponto de tempo de zero hora para obter a fração de atividade restante usando a equação e plote a fração de atividade restante em relação ao tempo. A atividade de HsADA1 do tipo selvagem diminuiu mais rapidamente no soro humano combinado em comparação com 1x PBS em cinco dias. As curvas de declínio de absorbância para HsADA1 do tipo selvagem mostraram uma inclinação inicial mais acentuada no dia zero em comparação com o dia cinco.
As amostras de controle negativo mostraram alteração de absorbância insignificante em comparação com as amostras de enzimas.
