Para começar, prepare uma câmara umidificada pegando uma grande caixa de slides e removendo a tampa de papelão colada à tampa. Coloque as toalhas de papel úmidas verticalmente na base da caixa de slides, certificando-se de que fiquem planas. Prepare a lâmina para coloração por desparafinização, reidratação, recuperação de antígeno e lavagem.
Remova a lâmina do PBS e limpe o excesso de PBS, evitando o lenço de papel. Com uma caneta hidrofóbica, desenhe uma caixa ao redor do tecido para formar uma barreira. Coloque a lâmina de contorno horizontalmente sobre as toalhas de papel úmidas.
Adicione aproximadamente 100 microlitros de tampão de bloqueio para cobrir o tecido. Feche a câmara umidificada e incube as lâminas em temperatura ambiente por 90 minutos. Em seguida, bata suavemente na solução de bloqueio.
Adicione imediatamente o bloco de rato com rato preparado para cobrir o tecido e incube à temperatura ambiente durante 15 minutos. No final da incubação, remova as lâminas da câmara umidificada e coloque-as diretamente em um rack de lâminas submerso em PBS. Em seguida, remova os slides do PBS.
Bata suavemente o excesso de PBS e coloque-os horizontalmente de volta na câmara umidificada. Adicione anticorpos primários de interesse adequadamente diluídos para cobrir o tecido. Depois que as lâminas forem removidas da câmara umidificada, retire suavemente os anticorpos primários e coloque-as em um rack de lâminas submerso em PBS por cinco minutos.
Depois de remover as lâminas do PBS e retirar o excesso de PBS, coloque-as horizontalmente de volta na câmara umidificada. Adicione fluoróforos de anticorpos secundários adequadamente diluídos ou anticorpos primários conjugados de interesse para cobrir o tecido. Em seguida, adicione Huist adequadamente diluído diretamente no tecido antes de incubar em temperatura ambiente no escuro.
Depois disso, coloque as lâminas em um novo prato resistente a solventes cheio de PBS por cinco minutos no escuro. Remova um slide de cada vez, mantendo os slides restantes submersos em PBS no escuro. Depois de remover o excesso de PBS, adicione uma a duas gotas de meio de montagem antidesbotamento no centro do tecido.
Segure uma lamínula limpa pelas bordas e abaixe-a lentamente na corrediça em um ângulo de 45 graus. Começando no centro do tecido, pressione suavemente a lamínula com dois dedos. Encaixe uma pipeta P200 cortada e não filtrada na ponta de uma pipeta serológica ligada a um vácuo.
Seguindo as bordas da lamínula, use o aspirador para remover o excesso de suporte de montagem. Em uma nova caixa de slides, coloque horizontalmente o slide na horizontal antes de deixá-lo secar no escuro em temperatura ambiente. Imagens microscópicas mostraram a morfologia de diferentes segmentos intestinais e coloração de células caliciformes.
A membrana apical, a membrana lateral das células epiteliais e os núcleos. A coloração imunofluorescente do intestino destacou muitos compartimentos celulares diferentes, incluindo células proliferativas, interstício, domínio lisossômico e epitélio.
