Antes da microscopia atômica da força ou das medidas do AFM, monte o modilhão em um bloco de vidro. Insira uma placa de Petri cheia de PBS no suporte do estágio do motor e insira o bloco de vidro na cabeça do AFM. Em seguida, posicione a cabeça do AFM sobre a placa de Petri de modo que o cantilever seja imerso no buffer e alinhe o laser manualmente.
No software JPK, pressione o botão de aproximação e aquisição para avançar o cantilever em uma superfície dura. Depois que a curva de distância de força única for adquirida, abra o gerenciador de calibração e, em método, selecione com base em contato. Em seguida, ajuste a temperatura ambiente para 20 graus Celsius.
Agora amplie a curva e selecione a parte linear para o ajuste de sensibilidade. Clique na caixa de seleção de sensibilidade e retraia o cantilever 200 micrômetros da superfície. Em seguida, marque a caixa de seleção do símbolo de infinito e clique em Executar ruído térmico.
Em seguida, amplie o gráfico de frequência resultante e defina um intervalo usando o botão direito do mouse. Marque a caixa de seleção Constante de mola e feche o gerenciador de calibração. Insira a placa de Petri contendo o membro de axolote regenerado embutido no bloco de tecido e no meio de cultura no suporte da placa do AFM.
Adquira uma imagem geral do bloco de tecido no modo de campo claro. Amplie a região de interesse e ajuste o tempo de exposição e o foco. Configure os parâmetros de grade para medições de recuo e registre uma matriz de curvas de força-distância.
Para processamento de dados no software PyJibe, abra o arquivo que contém a curva de deslocamento de força. Selecione a guia de pré-processamento e, na estimativa do ponto de contato, selecione o ajuste por partes com linha e polinômio. Em seguida, selecione a guia de ajuste e, em modelo, selecione penetrador esférico, em método, selecione nelder.
Para análise viscoelástica no software PyJibe, abra o arquivo que contém a curva de distância de força. Selecione a guia de pré-processamento e, na estimativa do ponto de contato, selecione o ajuste por partes com linha e polinômio. Em seguida, selecione a guia de ajuste e, em modelo, selecione o modelo Hertz corrigido para viscoelasticidade usando o modelo KVM.
Em método, selecione minimumsq. Defina o raio de entrada preciso para 10 micrômetros e a velocidade de aproximação para 7,5 micrômetros por segundo. Pressione Aplicar modelo e Ajustar tudo para obter os módulos de Young aparentes e não relaxados, a viscosidade aparente e o tempo de relaxamento do elemento de Maxwell.
As medidas do módulo de Young aparente do rádio e da ulna em membros íntegros não mostraram diferença significativa. Durante a fase de histólise, os módulos aparentes de Young do rádio e da ulna diminuíram drasticamente para 0,03 e 0,13 quilopascais, respectivamente. Os módulos de Young aparentes no centro da cartilagem íntegra eram maiores do que na periferia.
Na fase de histólise, as medidas aparentes do módulo de Young não mostraram diferença significativa entre o centro e a periferia da cartilagem. Durante a condensação da cartilagem, os módulos aparentes de Young aumentaram significativamente para 0,77 quilopascais, representando valores intermediários de rigidez. Os módulos não relaxados mostraram diferenças substanciais no tecido intacto durante a histólise e na cartilagem condensada.
Os módulos de Young aparentes foram altamente semelhantes aos módulos não relaxados, indicando uma resposta predominantemente elástica. A viscosidade aparente foi significativamente menor durante a histólise em comparação com o tecido intacto e a cartilagem condensada.
