Montagem e Processamento de Tecido Axolote para Medições de Microscopia de Força Atômica em Tecidos de Membros Intactos e em Regeneração

Para preparar cilindros de um centímetro de comprimento de um centímetro de diâmetro, aqueça um cortador de papelão sob uma chama de bico de Bunsen e corte um tubo de 15 mililitros com a lâmina aquecida. Cubra um lado dos cilindros com pedaços de Parafilm. Depois de anestesiar o axolote e certificar-se de que ele não responde a estímulos táteis, oriente o membro perpendicularmente ao eixo do corpo.

Amputar o membro imediatamente distal à área calcificada da região zeugopodial. Retorne o axolote a um tanque contendo água fresca com analgésicos. Após 24 horas, transfira o axolote de volta para água doce e deixe o membro se regenerar até o estágio desejado de interesse.

Depois de colocar o axolote anestesiado sob um microscópio estéreo, meça o comprimento do membro no estágio desejado de regeneração para os estágios de histólise e condensação da cartilagem. Depois de coletar os membros, coloque-os em uma placa de Petri para dissecação. Sob um microscópio estéreo, disseque os membros com um bisturi na altura do cotovelo e coloque-os em uma placa de Petri contendo solução de APBS.

Disponha as pipetas Pasteur e o termobloco ajustado a 37 graus Celsius com alíquotas de agarose na plataforma de trabalho. Remova o bloco frio do freezer de 20 graus Celsius negativos e coloque o cilindro com a extremidade coberta com o Parafilm voltada para baixo em cima dele. Coloque o membro em um prato limpo e remova suavemente o excesso de líquido do membro dissecado com papel de seda.

Adicione a agarose derretida de baixo ponto de fusão por cima e mova brevemente o membro na agarose para deslocar qualquer APBS restante da superfície da pele. Coloque rapidamente o membro dentro do cilindro, garantindo que ele esteja orientado verticalmente com a área de interesse voltada para cima. Adicione agarose de baixo ponto de fusão dentro do cilindro até que o tecido esteja totalmente coberto.

Em seguida, remova o cilindro do bloco frio e deixe a agarose solidificar por 30 segundos. Após a solidificação, remova o Parafilm do fundo do cilindro e prenda o tecido contendo agarose ao estágio de vibratomo com cola de cianoacrilato. Em seguida, remova qualquer excesso de agarose circundante com um bisturi.

Mergulhe o estágio na solução APBS para seccionamento. Comece a seccionar a agarose em etapas de 100 micrômetros até que a ponta do tecido seja alcançada. Em seguida, corte até que a porção distal do tecido seja removida.

Usando uma lâmina de barbear, remova cuidadosamente o bloco de agarose contendo tecido do estágio de vibratomo. Imediatamente, prenda o bloco a uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros com cola adesiva de tecido cirúrgico. Adicione aproximadamente dois mililitros de meio de cultura para cobrir o tecido.