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Agroinfiltração de folhas de plantas para estudo da localização de proteínas plasmodesmais

Transcrição

Para começar, cultive sementes de Nicotiana benthamiana em solo úmido dentro de uma câmara de ambiente controlado a 23 graus Celsius, mantendo 16 horas de luz, seguidas de oito horas de escuridão. Depois de transferir as mudas de duas semanas para vasos maiores, cultive as plantas nas mesmas condições por quatro a cinco semanas para prepará-las para experimentos de agroinfiltração. Liste Agrobacterium em células Mephasins EHA105 contendo vetores desejados em placas de ágar LB e incuba-as a 28 graus Celsius.

Após dois dias, transfira uma única colônia do prato para dois mililitros de caldo LB e incube durante a noite a 28 graus Celsius com agitação a 250 rotações por minuto. Em seguida, remova um mililitro da cultura durante a noite e adicione quatro mililitros de caldo LB fresco para recultivar por uma hora nas mesmas condições. Pellet as células por centrifugação.

Depois disso, determine a contagem de células da suspensão bacteriana em 600 nanômetros e ajuste a densidade óptica para 0,1 ou 0,2 usando tampão de infiltração. Incubar a suspensão bacteriana à temperatura ambiente durante três horas com agitação suave. Em seguida, infiltre a superfície abaxial de folhas totalmente expandidas de diferentes plantas usando uma seringa descartável sem agulha de um mililitro.

Marque a área infiltrada, que parecerá mais escura do que o tecido não infiltrado ao redor, com uma caneta à prova d'água.

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