Para começar, pegue 100 miligramas de tecido fresco ou 20 miligramas de tecido seco ao ar e coloque-o em um tubo de centrífuga de dois mililitros. Coloque dois grânulos de aço inoxidável de cinco milímetros no tubo da centrífuga e transfira-o para um moedor de lenços de papel de alto rendimento operando a 60 hertz por 60 segundos. Para extração de DNA, adicione 800 microlitros de tampão de isolamento nuclear pré-resfriado à amostra e coloque-a em um misturador de vórtice por cinco minutos.
Em seguida, coloque a amostra em uma centrífuga e gire a 13.780g por 10 minutos. Após centrifugação, remova o sobrenadante com cuidado. Em seguida, adicione 600 microlitros de tampão P1, seguidos de cinco microlitros de RNase A à amostra.
Após o vórtice, incubar as amostras em banho-maria a 65 graus Celsius por 1,5 horas, invertendo os tubos duas a três vezes durante a incubação. Em seguida, adicione 200 microlitros de Buffer P2. Homogeneizar. E coloque a amostra no gelo por 15 minutos.
Em seguida, centrifugue a 13.780g por 10 minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante para uma coluna de filtro AF e centrifugá-lo a 13 780 g durante dois minutos. Transferir o filtrado inferior para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mililitros.
Depois de calcular o volume do filtrado, adicione 1,5 vezes o volume do tampão P3 à amostra e agite imediatamente para misturar a amostra. Adicione 650 microlitros da mistura preparada a uma coluna de absorção e incube por cinco minutos. Em seguida, centrifugue a 13.780g por 30 a 60 segundos.
Adicionar novamente o filtrado obtido à coluna de absorção. Centrifugue e descarte o líquido residual. Lave a coluna duas vezes com 600 microlitros de solução de enxágue WB. Após a centrifugação, descarte o líquido residual e coloque a coluna de absorção em um tubo de coleta vazio.
Depois de centrifugar a amostra a 13.780g por dois minutos, deixe-a em temperatura ambiente para evaporar o etanol residual. Transfira a coluna de absorção para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro e adicione 45 microlitros de água deionizada esterilizada pré-aquecida a 65 graus Celsius ao centro da membrana adsorvente. Cinco minutos depois, centrifugue o tubo a 13.780g por dois minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, use um espectrofotômetro. Determine a concentração de DNA na solução filtrada. As proporções de absorbância de OD260 a OD280 variaram de 1,8 a 1,84, e a quantidade de DNA excedeu 100 nanogramas por microlitro, confirmando a boa qualidade do DNA extraído.
