Para começar, extraia o DNA do tecido vegetal e determine a concentração de DNA. Configure a reação depois de adicionar todos os componentes necessários a um tubo de centrífuga de 0,2 mililitro. Após a amplificação do primer, carregue três microlitros do produto de PCR e dois microlitros de um marcador de DNA de 5.000 pares de bases nos poços de um gel de agarose.
Defina a tensão para 120 volts, a corrente para 400 miliamperes e execute a eletroforese por 40 minutos. Use um sistema versátil de análise de imagem de gel para visualizar e analisar os resultados do gel. Depois de executar o exemplo por meio de uma unidade de sequenciamento, selecione Criar um novo projeto e clique em OK para ir para a página inicial do software.
No menu Arquivo, selecione Importar e Adicionar Amostras. Escolha o arquivo de formato de rastreio de sequência e importe-o como o arquivo a ser processado em amostras não montadas. Escolha Contig.
Em seguida, vá para Montagem avançada e selecione Montar em grupos. Quando a caixa de diálogo solicitando a definição de nomes for exibida, modifique o nome do arquivo na seção definir peças de nome de amostra e clique em Montar para exibir a sequência alinhada. Selecione Ir, escolha Sequência de Pesquisa e clique em OK para encontrar a sequência correspondente.
Escolha Contig e, em seguida, selecione Excluir para remover as regiões 5.8S e 28S, juntamente com quaisquer sequências de baixa qualidade. Exporte a saída com as sequências emendadas para correspondência. Selecione uma pesquisa BLAST usando o banco de dados de nucleotídeos no NCBI.
Escolha a ferramenta de identificação de espécies e o primer específico ITS-2, correspondente ao Banco de Dados do Genoma da Farmacopeia Global. Baixe sequências de três espécies de Angélica e uma espécie de Peucedanum praeruptorum como um grupo externo do NCBI. Analise essas sequências junto com as sequências de resultados obtidas.
Em seguida, clique em Arquivo. Selecione Abrir um arquivo ou sessão para importar o arquivo e uma caixa de diálogo será exibida. Escolha Align seguido de DNA e selecione Align by ClustalW para comparação de sequência.
Navegue até a filogenia e clique em Construir árvore de junção de vizinhos de teste para gerar uma árvore filogenética. Os resultados da eletroforese em gel mostraram bandas claras únicas em torno de 500 pares de bases para as amostras AS1, AS2 e AS3, sem bandas no controle negativo, indicando amplificação bem-sucedida do DNA extraído. Os resultados do sequenciamento identificaram Angelica sinensis com 100% de similaridade de sequência usando BLAST, combinando os resultados do banco de dados GPGD.
Na análise filogenética, as sequências de splicing agruparam-se com Angelica sinensis OR8797150.1, com um valor de suporte de bootstrap de 100, comprovando a identificação como Angelica sinensis.
