Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsa nenhuma. 213/09 do israelense Science Foundation, conceder nenhum. 2005258 desde a fundação BSF, não conceder. 201665 a partir do Conselho Europeu de Investigação (ERC), e pelo Instituto de Nanotecnologia Russell Berrie no Technion. Reconhecemos a ajuda do Prof Noam Adir e Salame Faris pela Faculdade Schulich de Química da Technion sobre o fornecimento e manuseio das cianobactérias. A ajuda eo apoio de Svetlana Yoffis da Unidade de Fabricação Technion Micro-Nano é muito apreciada.

1. Visão geral do ESR Micro-imagem Primeiro, nós fornecemos uma breve explicação do ESR, microscopia ESR, e os vários componentes do nosso sistema, e em seguida iremos descrever as experiências de imagem real. Ressonância paramagnética eletrônica é uma técnica espectroscópica em que a radiação eletromagnética em uma freqüência específica é absorvida pelas moléculas com spins elétron desemparelhado, colocada sob um campo magnético externo estático (Figura 1). ESR é empregada em grandes áreas da ciência, como química, biologia, física e ciência dos materiais, para a detecção e identificação de radicais livres e centros paramagnéticos. É um poderoso método para estudar o ambiente de moléculas paramagnéticas em espécies vivas e fornece informações sobre a acidez (pH), viscosidade, oxigênio e espécies reativas de oxigênio concentrações 3. Para amostras heterogêneas, ESR informação espectral pode ser obtido de uma forma espacialmente resolvidos (ie, através da obtenção de uma imagem), através do uso de gradientes de campo magnético 4. Isto é muito semelhante ao método mais comum de ressonância magnética (MRI), que gira principalmente observa próton. Até agora, as técnicas de imagem, ESR foram aplicados para espécimes vivos com tamanho relativamente grande de alguns centímetros e milímetros escala resolução. (Por exemplo, veja a Figura 2, retirados de referência 5.) Desenvolvimento relativamente recente no ESR imagem é a extensão de sua capacidade de olhar para pequenos animais em milímetros escala resolução para as medições de amostras milímetros e sub-milímetro de tamanho com escala mícron resolução. Este campo é conhecida como microscopia de ESR, que hoje pode fornecer imagens 3D ESR com uma resolução de 1 mícron aproximando 2 (ver exemplos representativos na Figura 3). ESR de um microscópio é essencialmente similar a um espectrômetro de ESR convencionais. Ele tem um ímã para a geração do campo estático, um sistema de microondas para a excitação de spin e detecção do sinal, uma sonda para a realização da amostra, e um console informatizado para controlar o processo de aquisição e manipulação de dados. Outros componentes de imagem a única ESR em geral e existentes também em microscopia ESR são fontes de campo magnético de gradiente, que são parte do sistema eletrônico, e bobinas de gradiente que estão localizados na sonda de imagem. Mais detalhes sobre o nosso sistema específico são mostrados no filme de protocolo e descrito na referência 2. 2. ESR Preparação da Amostra Micro-imagem Esta etapa descreve o método para preparação de amostras para o experimento ESR micro-imagem. No final desta fase as células são colocadas no fundo de um recipiente de vidro ESR especialmente preparado amostra microscopia juntamente com uma solução tampão por tritila radical 6. Este protocolo descreve a medição de células de cianobactérias e, portanto, para outros tipos de células, ajustes adequados podem ser necessários na fase de preparação da amostra. <ol><li> Primeiro, alguns quadrados de papel absorvente com um tamanho de 400 ~ 400 m são tomadas e inserido em um tubo Eppendorf, que é posteriormente preenchida com 1,2 mL da suspensão cianobactérias (a uma concentração de 40 mg / mL). </li><li> A suspensão é centrifugada por 2 minutos a 6000 RPM em microcentrífuga. </li><li> Depois disso, o buffer sobrenadante é completamente removido, exceto para ~ 50 mL que são deixados para evitar a desidratação cianobactérias. Como resultado deste processo, o papel absorvente agora saturados pelas células de cianobactérias. </li><li> Usando uma pinça fina, algumas fibras são extraídas do papel e colocados no fundo de um suporte de copo-como amostra preparada especialmente de vidro 7. Seguinte ao de 3 mm de tritila em BG-11 solução de 8, 9 (ver Esquema 1) é adicionado ao porta-amostras com a ajuda de uma seringa bem. O titular é então selada com cola curável UV, deixando uma pequena saída de ar aberto. <table border="1"><tbody><tr><td> Stock 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Stock 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 EDTA Mg 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> 0.6g/liter citrato férrico de amônio </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Ácido cítrico: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Esquema 1. Preparação de BG-11 médio. </li></ol> 3. ESR Micro-imagem Experimentos <ol><li> Para começar o experimento de imagem, ligar o sistema ESR micro-imagem e inserir a amostra no ressonador que vai dentro da sonda de imagem. </li><li> Agora, usando o software de controle de computador, defina o sistema em &quot;Tune&quot; e encontrar o modo de freqüência de microondas de ressonância da sonda, que será usado para as medições ESR. </li><li> Em seguida, defina o campo magnético estático sobre o valor que corresponda à freqüência de microondas aplicada, definir os parâmetros de tempo para a seqüência de pulso e observar o sinal de ESR para se certificar de que o sistema funcione bem e que a amostra é bem preparado. </li><li> Em seguida, defina os parâmetros de imagem, tais como o número de pixels, a força do gradiente, bem como a duração dos pulsos de gradiente para seus valores necessários. </li><li> Após a instalação, coletar três imagens 3D ESR por uma imagem echo Hahn seqüência de pulsos (Figura 4) com interpulso separação, valores de  500, 600 e 700 ns. </li><li> Luz projetada na amostra é ligado ou desligado, dependendo das condições necessárias experimental. </li><li> Durante a aquisição, os dados são salvos automaticamente. Teses arquivos de dados brutos são então processadas via Matlab script de software para fornecer imagens da concentração por tritila radical eo tempo de relaxamento T mapa 2, que é traduzido em uma imagem concentração de oxigênio através de pré-existentes de calibração. </li></ol> 4. Resultados representante Os resultados do experimento são várias tridimensional ESR micro-imagens gravadas em diferentes valores de τ. Típico imagens brutas dados são fornecidos na Figura 5. As três principais imagens, medido em condições escuro, são muito semelhantes, exceto para a redução da intensidade do sinal. Por outro lado, a imagem muda padrão sob irradiação de luz devido aos tempos de relaxação diferentes em diferentes partes da amostra. Estes dados podem ser processados ​​1 para obter uma imagem amplitude, como mostrado na Figura 6 e também imagens do tempo de relaxação, T 2 (Figura 7). A T 2 imagens são traduzidas em valores de concentração de oxigênio através de uma curva de calibração pré-existente que liga a concentração de oxigênio para o tempo de relaxamento através da equação: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Equação 1" /> Aqui, T 2 0 é o tempo de relaxação spin-spin da sonda sob condições anóxicas (dependendo da concentração da sonda, C, e seu coeficiente de difusão, D), e k é uma constante de proporcionalidade. Na maioria dos casos, o coeficiente de difusão não varia muito para amostras ao vivo (embora, se necessário, ele pode, em princípio, ser diretamente avaliada também por ESR 6, 10), ea concentração de spin é obtida durante o processo de imagem. Portanto, essa relação pode ser utilizada para medir diretamente a concentração de oxigênio. Voltando à Figura 6, é evidente a partir da imagem amplitude que as células de cianobactérias foram localizados principalmente no lado direito do titular da amostra. Além disso, com base na Figura 7, é claro que a luz inicia a produção de O 2 e provoca um aumento significativo da concentração da solução 2 O, principalmente nos voxels perto do cianobactérias. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Níveis de energia em elétrons de ressonância spin. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: imagem de concentração típica de oxigênio de um rato do rolamento do tumor. A imagem da esquerda mostra as informações anatômicas, com base em uma imagem de ressonância magnética. Um estável livre radical orgânico foi injetado para o mouse e as suas características ESR fornecer a concentração de oxigênio em seu ambiente (direita). ESR baseado em resultados são sobrepostos a imagens anatômicas de ressonância magnética. Campo de visão é de 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Dois exemplos de alta resolução ES micro-escalaR imagens de amostra photolithographically gerados com N @ C 60 em pó (à esquerda) e cristais paramagnéticos LiPc (à direita) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Típica Hahn imagem seqüência de pulsos mostrando o microondas (MW) e gradiente, G x, y G e G z pulsos. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Típica-prima de dados ESR micro-imagens: a, b e c são dados brutos da amostra cianobactéria sem iluminação de luz medido para τ = 500600700 ns, respectivamente. Itens d, e, e são os mesmos que a, b e c, mas com iluminação de luz. Intensidade é plotado em escala arbitrária (mas é consistente dentro de cada conjunto de três imagens escuras ou claras de dados brutos) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: imagem de amplitude correspondente à concentração de radicais na solução (escala arbitrária). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7: T 2 imagens e os correspondentes [O 2] valores no escuro (à esquerda) e leve (à direita) condições.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo mostra como ESR micro-imagem pode ser aplicada para mapear a concentração de oxigênio próximo ao vivo pequenas amostras. A resolução espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 M é demonstrado, com quase micromolar sensibilidade concentração de oxigênio e sub-femtomole sensibilidade de oxigênio absoluto por voxel. O uso de ESR micro-imagem para o mapeamento de oxigênio perto células complementa as técnicas atualmente disponíveis com base em micro-eletrodos ou de fluorescência / fosforescência. Além disso, com a sonda paramagnética adequada, ela será prontamente aplicável para oxigênio intracelular micro-imagens, uma capacidade que outros métodos achar muito difícil de alcançar. Num futuro próximo pretendemos melhorar ainda mais esta metodologia para fornecer imagens de amostra ao vivo com uma resolução de alguns mícrons, fornecendo parâmetros de contraste, como a concentração de óxido de super, acidez (pH), coeficiente de difusão da sonda e, claro, a concentração de oxigênio. Estas capacidades são complementares à atual ótica metodologias baseadas tanto em termos de tipo de contraste e de amostras de características (por exemplo, não transparente amostras de espessura e, em alguns casos, as medidas contra intracelular extracelular).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Este protocolo descreve uma ressonância paramagnética eletrônica (ESR) método de micro-imagem para mapeamento tridimensional de níveis de oxigênio no ambiente imediato de células vivas com escala mícron resolução 1. O oxigênio é uma das moléculas mais importantes no ciclo de vida. Ele serve como receptor de elétrons terminal da fosforilação oxidativa na mitocôndria e é usado na produção de espécies reativas de oxigênio. Medições de oxigênio são importantes para o estudo das funções mitocondrial e metabólicas, vias de sinalização, os efeitos de vários estímulos, permeabilidade da membrana e diferenciação doença. Consumo de oxigênio é, portanto, um marcador informativo do metabolismo celular, que é amplamente aplicável a vários sistemas biológicos a partir de mitocôndrias de células de organismos inteiros. Devido à sua importância, muitos métodos foram desenvolvidos para as medições de oxigênio em sistemas vivos. Tentativas atuais para fornecer imagens de alta resolução de oxigênio são baseados principalmente em fluorescência óptica e os métodos de fosforescência que não fornecem resultados satisfatórios como eles empregam sensores com alta foto-toxicidade e sensibilidade baixa de oxigênio. ESR, que mede o sinal das sondas paramagnéticas exógena na amostra, é conhecido para fornecer medições muito precisas da concentração de oxigênio. Em um caso típico, as medições ESR mapa LineShape ampliação da sonda e / ou tempo de relaxamento-encurtamento que estão ligados diretamente à concentração de oxigênio local. (O oxigênio é paramagnético, portanto, quando colidiu com a sonda paramagnética exógenos, que falta vezes o seu relaxamento.) Tradicionalmente, esses tipos de experimentos são realizados com baixa resolução, milímetro escala ESR para geração de imagens de pequenos animais. Aqui nós mostramos como ESR imagem também pode ser realizado na escala mícron para o exame de pequenas amostras de viver. ESR micro-imagem é uma metodologia relativamente nova que permite a aquisição de sinais espacialmente resolvido com uma resolução ESR se aproximando de 1 mícron em temperatura ambiente 2. O principal objectivo deste protocolo papel é mostrar como este novo método, juntamente com o recém-desenvolvidos de oxigênio-sensível sondas, pode ser aplicado para o mapeamento dos níveis de oxigênio em pequenas amostras de viver. A resolução espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 M é demonstrado, com quase micromolar sensibilidade concentração de oxigênio e sub-femtomole sensibilidade de oxigênio absoluto por voxel. O uso de ESR micro-imagem para o mapeamento de oxigênio perto células complementa as técnicas atualmente disponíveis com base em micro-eletrodos ou de fluorescência / fosforescência. Além disso, com a sonda paramagnética adequada, mas também irá ser facilmente aplicável para oxigênio intracelular micro-imagens, uma capacidade que outros métodos achar muito difícil de alcançar.

Watch this Scientific Journal Video about Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping at JoVE.com

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Este protocolo descreve um método para escala mícron imagem tridimensional da concentração de oxigênio no ambiente imediato de células vivas por microscopia eletrônica de spin ressonância.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K visualizações.  The Technion, Israel Institute of Technology. Este protocolo descreve um método para escala mícron imagem tridimensional da concentração de oxigênio no ambiente imediato de células vivas por microscopia eletrônica de spin ressonância.

Vídeo: Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biologia

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...