Este trabalho foi apoiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, o Centre National de la Recherche Scientifique, da Université de Strasbourg, o Hôpital de Estrasburgo, a Associação pour la Recherche sur le Câncer, o Instituto Nacional do Câncer du, a Agence Nationale de la Recherche ea região da Alsácia. Pietro Laneve tem sido apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale. Atualmente, ele é um receptor de um companheirismo Istituto Italiano Tecnologia (IIT). Os custos de publicação são suportados pela rede Neurex (TriNeuron - Programa Interreg IV Alto Reno)

Coleção 1 Amostra <ol><li> Separe duas células semi-aderente de Schneider, (1-5 x 10 6 células, em média), por pipetagem e colhê-las por centrifugação (100 xg por 1 min). Em caso de in vitro células aderentes cultivadas, trypsinize-los em condições normais ou diretamente coletá-los de placas em uma quantidade conveniente de reagente de extração de RNA, com a ajuda de um raspador de células. </li><li> Para a coleta de embriões, crescer estirpes de Drosophila em gaiolas mosca e deixar acumular embriões em placas de ovos de postura. Wipe embriões fora por um pincel em água destilada (dH2O), descartar detritos por crivo de filtragem, lavagem e recuperação de embriões num frasco 48. </li><li> Como uma técnica alternativa, dissecar manualmente os tecidos / órgãos. Isolar testículos (um sistema preferencial para análise piRNA) de Drosophila abdômen em tampão fosfato (PBS) sob microscópio estereoscópico (aumento de 20X), usando agulhas de dissecação ou fórceps como visualized em Sullivan et al 49. </li><li> Pilão homogeneizar amostras sobre vício de 0,5 volumes de reagente de extração de RNA. </li></ol> 2 Extração de RNA / Análise <ol><li> As instruções do fabricante efectuar o isolamento do RNA através de reagentes comerciais. CUIDADO! Agentes de extração de RNA são geralmente tóxico e corrosivo. Alternativamente, aplicam um protocolo baseado em Proteinase K para o isolamento de ARN de 50, como se segue: <ol><li> Diluir as amostras em 400 ul de paragem Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Recuperar os componentes hidrossolúveis de fenol padrão: clorofórmio: álcool isoamílico e extracções de clorofórmio e de etanol (EtOH) a precipitação / lavagem. Air secar as amostras e ressuspender em dietilpirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com dupla destilada (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Avaliar a concentração de ARN por espectrofotometria de UV. Também garantir a pureza RNA é alta, perto de 2.0, based em A 260 / A leitura 280. </li><li> Verificar preparação de ARN em gel de agarose desnaturante, como se segue: <ol><li> Num copo limpo, dissolve-se 1,2 g de agarose em 82 ml de DEPC-ddH2O, sob agitação contínua. Ferva até dissolver completamente. </li><li> Permitir que a solução gel para esfriar; quando a temperatura chega a 60 ° C adicionar 10 ml de ácido 4-10X morpholinepropanesulfonic (MOPS) buffer para 1X concentração final (FC), e 8 ml de formaldeído a 37% para 3% FC. CUIDADO! formaldeído é uma substância cancerígena. </li><li> Verter o gel numa célula de electroforese horizontal. Permitir que o gel solidifique sob uma capa, durante pelo menos 1 hr. Após solidificação, submergir o gel em MOPS 1X. </li><li> Alíquota de 2 mg de amostra de RNA e 1 mg de Escada (use um marcador de RNA quando avaliação precisa é desejada). Adicionar 3 volumes de corante de carga de agarose (ALD) de ARN e a escada. Aquece-se a 70 ° C durante 5 minutos e imediatamente em gelo fresco. CABuição! Índice de ALD (brometo de etídio e formamida, veja Materiais) são mutagênico e corrosivo, respectivamente. </li><li> Coloque as amostras e correr o gel a 50 V durante cerca de 1 hora com tampão de reciclagem ocasional. Verifique o padrão de RNA fracionamento através da visualização de imagens UV ou gel. Reconhecer bandas discretas correspondentes a 28S e 18S ARNr e ARNt (ver Figura 1). </li></ol></li><li> Siga para norte Ensaio ou loja de RNA a -80 ° C. </li></ol> 3. desnaturação Acrylamide Gel Preparação <ol><li> Use um pequeno aparelho verticais eletroforética para esta etapa de fracionamento (tamanho da placa de cerca de 8 cm x 9 cm, espessura pente 0,75 milímetros). </li><li> Montar copos limpos juntos em um quadro de qualidade. </li><li> Preparar 10 ml de 10% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) solução de MOPS 1X, 7 M de ureia. Imediatamente antes de servir, adicione 100 ml de 10% de persulfato de amónio e 10 ml de Temed e misture rapidamente a solução. CUIDADOA acrilamida! É neurotóxica e cancerígena. </li><li> Despeje o gel entre as placas de vidro e inserir o pente bem cuidado para evitar bolhas. Deixar o gel de polimerizar à temperatura ambiente durante pelo menos 45 min antes da utilização. Em alternativa, guarde o O gel / N, embrulhado em papel de filtro umedecidos com água e selado em saran wrap. </li></ol> Preparação 4 Amostra <ol><li> Aliquota 0,5-20 ug de ARN total para cada amostra. Se o volume for superior a 3-4 mL, a amostra seca sob vácuo. </li><li> Para a determinação do tamanho, executar-se uma alíquota (20-30 cps) radiomarcado de escada de baixa gama de amostras em paralelo, tal como um marcador (ver secções 4.3 e 4.4 para a preparação). Tratá-lo em paralelo com as amostras, como descrito no passo 4.5. </li><li> Ladder: criar uma reação direta de fosfato utilizando 0,1 g de uma escada de 10 bp-passo. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos e parar a reacção pela adição de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 20 mM de FC. </li><li> Purifica-se por precipitação de EtOH / lavagem, ar seco eressuspender em ddH 2 O (cerca de 100 mL). CUIDADO 32 P é uma fonte radioactiva. </li><li> Para cada amostra, adicionar um volume igual de corante azul de acrilamida (ABD). Desnaturação por aquecimento a 80 ° C durante 5 minutos e deixar arrefecer sobre gelo até à carga. ATENÇÃO! Formamida (conteúdo em ABD) é corrosivo. </li></ol> 5. Electrophoretic Fracionamento <ol><li> Retirar as placas de vidro a partir do suporte de fundição e montá-los adequadamente na célula de electroforese. Preencha ambos câmara interna e externa com suficiente tampão de corrida (RB). </li><li> Remova cuidadosamente o pente e pré-executar o gel a 200 V durante 10 min. Antes de colocar as amostras, lavar depósitos de uréia dos poços por esguichar alguns RB através de uma seringa. </li><li> Utilizar pontas planas para estratificar cuidadosamente amostras de 4,5 passo no fundo de cada poço. Verifique as conexões de ânodo e do cátodo para evitar a execução invertida. Após as amostras de entrar no gel a 100 V durante 5 minutos, increase a tensão de 200 V. </li><li> Para um comprimento de fraccionamento de cerca de 7 cm, a 45 min-longo prazo é suficiente. Evite Azul de bromofenol (um pigmento de rastreamento em ABD) a transbordar o gel. </li><li> Visualizar no gel os RNAs longos fraccionados por brometo de etídio (EtBr) a coloração, como um passo opcional: <ol><li> Cortar a 2 cm da superfície do gel e lavar rapidamente a fatia em ddH 2 O. </li><li> Incubar a fatia de gel, à temperatura ambiente, durante 15 min com Shacking suave em RB, EtBr a 0,5 ug / ml de FC. </li><li> Destain o gel durante 15 minutos em RB, visualizar longos rRNAs por irradiação de UV ou de imagem em gel. Verifique se há carga RNA e qualidade (veja a Figura 1, Painel 7). CUIDADO! Brometo de etídio é um agente mutagênico. </li></ol></li><li> Enquanto isso proceder blotting a parte inferior do gel contendo as espécies de ARN pequenas. </li></ol> 6. Gel Blotting <ol><li> Corte 6 pedaços de papel mata-borrão para caber na área da mancha e uma peça equivalente de uncharged membrana de nylon. Umedeça as folhas de papel, membrana e duas almofadas de mancha em RB. Certifique-se de mergulhar completamente as almofadas por várias vezes apertando-as em RB. </li><li> Remover o gel a partir do aparelho e abrir os vidros por meio de uma espátula. Usar um cortador limpa para remover os poços. Coloque uma folha de papel filtro molhado no gel e cuidado, retire-se. </li><li> Colocar a membrana de nylon sobre a face livre do gel. Marcar um canto para orientar o filtro de acordo com a carga da amostra. Complete o &quot;sanduíche&quot; (3 peças de papel de cada lado). Rolar uma vareta de plástico na superfície da mancha, para remover eventuais bolhas de ar. </li><li> Coloque a mancha entre duas almofadas de mata-borrão e, em seguida, na cassete borrar. Monte o cassete no módulo de mata-borrão, encher a câmara com RB e procure a orientação correta (membrana de nylon deve ficar entre o gel eo terminal positivo). </li><li> Transferir a 20 V durante 20 min. Nota: para garantir condições homogêneas, depois de 10 min abrir o módulo de mata-borrão e rotate o sanduíche em 180 ° antes de completar a transferência. </li></ol> 7 Membrana reticulação <ol><li> Prepare a 6 ml de solução de reticulação fresco (XLS). Saturar com 10 cm x 10 cm (maiores do que uma membrana de nylon) pedaço de papel mata-borrão com XLS. ATENÇÃO! HCl (um componente de XLS) é altamente corrosivo. </li><li> Desmantelar o blot e colocar a membrana sobre o papel de filtro 3MM molhado. Nota: RNA não deve estar em contato direto com o papel saturada. Colocar o filtro eo papel entre duas placas de vidro e enrole em Saran-wrap. </li><li> Aquece-se a membrana a 60 ° C durante 2 horas, seguido por uma lavagem ddH2O. Armazenar a -20 ° C ou prosseguir para a hibridação. </li></ol> 8 Membrana prï¿½hibridaï¿½o <ol><li> Se RNA carregamento tenha sido verificado (etapa opcional 5.5), vá diretamente para a hibridização. Ou então, cortado distância de 1 cm para a parte superior do filtro de nylon, a fim de evitar sonda cruzada hybridizations a RNAs longos fraccionados. </li><li> Pré-aqueça 10 ml de solução de hibridação (HS) a 37 ° C. Desnaturar um mg de esperma de salmão a 95 ° C durante 5 min, em gelo frio e adicionar a SH. </li><li> Incubar o filtro em HS a 37 durante pelo menos 1 hora, sob rotação, em um forno de hibridação. Verifique se o RNA-side do filtro enfrenta HS. </li></ol> 9 Probe Synthesis <ol><li> Configurar uma reação direta de fosfato em 10 pmol de oligonucleotídeo antisense específico, conforme descrito no item 4.3. </li><li> Adicionam-se 5 volumes de Tris-EDTA-NaCl (RT) para o tampão de reacção e purifica-se o iniciador marcado de nucleótidos não incorporados por cromatografia de exclusão em gel numa coluna de Sephadex G-25 (ou também por precipitação de EtOH). Sonda actividade pode ser avaliada por cintilação líquida contador. </li></ol> 10 Membrana Hibridização <ol><li> Substitua o HS exausto com um novo 10 ml alíquota (preparado e complementado conforme descrito acima). Aqueça a sonda em95 ° C durante 10 min, em gelo fresco e adiciona-se a novos HS. Incubar o filtro a 37 ° C NA. </li></ol> 11 Membrana de lavar <ol><li> Recuperar a solução de hibridização e armazená-lo a -20 ° C numa caixa de blindagem de radioactividade. </li><li> Lave o filtro em tampão de lavagem (WB) e lave-o bem por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Use um Geiger Mueller Detector para verificação radioatividade residual nos cantos de filtro. Quando a emissão de fundo é de cerca de 5 cps, proceder à membrana exposição. </li></ol> Detecção de Sinal 12 <ol><li> Exponha o filtro em filmes de autorradiografia ou na tela de um gerador de imagens molecular ON. Revelar sinais por processamento fotográfico ou conversão digital. </li><li> Analisar a intensidade da banda por software quantificação dedicado (ImageJ ou Optiquant). </li></ol> 13 Membrana Stripping <ol><li> Para remover sinais primários, submergir a membrana em 500 mL de solução de decapagem de ebulição, Em seguida incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Proceder-se a novos (pré) hibridação ou armazenar o filtro a -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Embora a nossa apreciação do sofisticado entrelaçamento por meio do qual o RNA regula a neurogênese é cada vez maior, as implicações mecanicistas de circuitos baseados no RNA que afetam a biologia neural de células-tronco, a diferenciação neuronal / integração funcional, desenvolvimento de patologias neurais e cânceres permanecem inexplorados. A manutenção dessas redes através de reinos faz com que o potencial dos sistemas genéticos como Drosophila melanogaster instrumental para desvendar camin...

RNA bioquímica tem experimentado avanços espetaculares nos últimos anos 1. A nossa compreensão de ARN potencial no controlo da expressão de genes tem sido perfurados por a identificação de poderosos noncoding ribo-reguladores 2, com a descoberta de novos mecanismos de regulação baseados no RNA 3,4 e por uma caracterização mais profunda de eventos pós-transcrição já conhecidos 5. Todos biologia RNA juntos estes estudos têm permissão para fazer drasticamente a cena, tornando-se um importante tema de pesquisa na paisagem científica atual. Em particular, nos últimos anos estamos recebendo uma noção do impacto generalizado do &quot;mundo de RNA&quot; em neurobiologia molecular 6, um dos campos de pesquisa mais dinâmicos da ciência da vida moderna. Na última década do século passado, o cenário científico global foi revolucionado pela descoberta da interferência de RNA 7,8 e dos pequenos RNAs regulatórios 9,10nomeadamente em matéria de microRNAs 11, endogenamente expressa pequenos RNAs não-codificantes envolvidos no controle de quase todas as funções celulares como reguladores pleiotrópicos e combinatórias de expressão gênica. Quase 10 anos depois de miRNA descoberta inicial em Caenorhabditis elegans por Ambros e laboratórios da Ruvkun, renovada atenção voltou-se para o campo quando um elevado número de miRNAs foram identificados em Drosophila e em células humanas, bem 12-15. Desde então, graças às abordagens transgênicas versáteis, Drosophila melanogaster tem se destacado como um contexto biológico valioso para aprofundar em miRNA biossíntese e atividade. Drosophila miRNAs têm revelado funções distintas em processos de insetos específicos ou conservados evolutivamente, que vão desde o envelhecimento ao metabolismo, vias de sinalização , comportamento e, é claro, neurogenesis. Ao longo desta direção, que recentemente lançou um novo link de 16 em co intriganterrelation ocorrendo entre o gene mestre GCM / glide ea via RNA. O fator de transcrição fly Gcm / Glide 17-19 constitui um exemplo único de determinante do destino da célula, o que determina a escolha destino neuronal glial vs. em multipotentes voar precursores neurais 20. Vinte anos longa investigação sobre este tema sublinhou claramente a ocorrência de múltiplas e sobrepostas entradas de regulação da expressão gênica convergindo sobre GCM / deslizar 21-28 para estabelecer os limiares necessários para equilibrar a relação delicada entre as partes neuronais e gliais durante o desenvolvimento neural. Descobrimos que a regulação via DMEL-miR279 segmentação representa um novo nível de controle que contribui para a pós-transcricional ajuste fino da GCM / deslizar expressão 16. Melhorias metodológicas específicas Globalmente, estas linhas de pesquisa têm exigido: ao longo dos anos, várias tecnologias originalmente desenvolvidas para analisar tradRNAs itional foram convertidos para quantificar pequenos RNAs não codificantes, como como ensaios de proteção RNase cDNA matrizes 29-31, em tempo real, métodos de PCR e sequenciamento 32-35 36,37. Por outro lado, a recalibração de abordagens técnicas promoveu avanços contínuos no campo. Northern blot (NB, ou ensaio de mancha de gel de ARN) constitui um exemplo representativo: é largamente utilizado para o perfil de acumulação de ARN, uma vez que garante a expressão de nível de quantificação, bem como determinação do tamanho. No entanto, a fraca sensibilidade intrínseca do método é limitante quando é para ser aplicada à expressão do gene finas sintonizadores baixa abundantes, como RNAs curtos. Uma consequência prejudicial é o requisito de grandes quantidades de RNA total, o que torna difícil a sua aplicação para amostras biológicas específicas. Por tais razões, variantes NB específicos para detecção de RNAs pequenos foram desenvolvidos 38-40: aproveitamos uma melhor proc NBedure 41 (ENB, Avançado Northern Blot), enquanto elucidar a interação entre DMEL-miR279 e GCM / glide acima referido. Este método baseia-se num passo de reticulação química com base na actividade de um derivado de carbodiimida [1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fixar o ácido nucleico em suportes sólidos. Carbodiimida é um agente de reticulação versátil conhecida para catalisar a formação de ligações amida entre os grupos carboxilo activados ou fosfato e os grupos de amina 42. Esta propriedade pode ser explorada para acoplar covalentemente pequenos RNAs através do seu grupo 5 &#39;-hidroxilo de mono-fosforilada em grupos amino na superfície de membranas de nylon. A configuração do acessório resultante aumenta a acessibilidade do ácido nucleico imobilizado e, por sua vez, a eficiência da hibridação sonda-alvo, o que resulta em aumento notável de detecção 43. A técnica assume particular relevance em estudos moleculares de Drosophila, pelo que a ocorrência de aulas novas e distintivas de pequenos RNAs não-codificantes está emergindo 44. Entre estes, rasiRNAs 45,46 constituem um subtipo específico de RNAs-interagindo Piwi (piRNAs 47), envolvidos no silenciamento de genes de seqüência específica. Detalhes da operação deste método estão completamente descritos e visualizadas a seguir, em relação com a análise da microRNAs DMEL-miR279 e DMEL-miR286 e, pela primeira vez, de uma rasiRNA, rasi4. Nós levado ao extremo este método, o que nos permitiu revelar alvos mal expressas de quantidades mínimas de RNA (menos de 1 mg).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

As últimas décadas têm testemunhado a explosão do interesse científico em torno de mecanismos de controle de expressão gênica em nível de RNA. Este ramo da biologia molecular tem sido grandemente impulsionado pela descoberta de RNAs não-codificantes como principais intervenientes na regulação pós-transcricional. Tal perspectiva revolucionária tem sido acompanhado e desencadeada pelo desenvolvimento de tecnologias poderosas para criação de perfil curto expressão RNAs, tanto no nível de alto rendimento (número de identificação do genoma) ou como análise-candidato único (acúmulo de estado estacionário de espécies específicas). Embora várias estratégias estado-da-arte estão atualmente disponíveis para a dosagem ou visualizar tais moléculas que fogem, ensaio Northern Blot continua a ser a abordagem elegíveis em biologia molecular para a avaliação precisa e imediata de expressão do RNA. Ela representa um primeiro passo para a aplicação de tecnologias caras mais sofisticados e, em muitos casos, continua a ser um método preferencial para ganhar facilmente descobertasem biologia ARN. Aqui nós overview um protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs fracamente expressos (ou outras espécies de pequenos RNA reguladores) de Drosophila melanogaster embriões inteiros, dissecados manualmente tecidos / adultos ou larvas em células cultivadas in vitro. Uma quantidade muito limitada de RNA é necessária e do uso de material de fluxo de células isoladas de citometria pode ser também prevista.

Seguindo o procedimento geral descrito no texto e esquematicamente representado na Figura 1, avaliou-se a expressão pequenos RNAs de amostras de ARN de complexos de diferentes origens. Na experiência apresentada na Figura 1, o RNA foi isolado a partir de duas células de Schneider de Drosophila por proteinase K, extracção controlados quanto à integridade (passo opcional: desnaturação de fraccionamento em gel de agarose) e carregado em duas vezes. Uma metade do gel foi tr...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K visualizações.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas. 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...