Somos gratos a Samuel Shepard, Bazeley Peter, David e John Bell para a administração da Genomic páginas web de ressonância magnética. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Carreira prémio &quot;Investigação de papéis intron celular&quot; [número de concessão MCB-0643542].

Todos os programas usados ​​no papel ter sido escrito usando perl, e todas as páginas web foram criados usando PHP. 1. Ponto de partida: Abra a home page do pacote de Genomic on-line por ressonância magnética no http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri /. O recurso da Web também oferece instruções / explicações sobre os programas do &quot;Ajuda (How-to/README)&quot; link, enquanto todos os materiais publicados no Genomic algoritmos de ressonância magnética e similares são listadas na seção &quot;Links para recursos relevantes&quot; link. 2. Preparação e Upload de seqüência de entrada (s). Crie um arquivo com FASTA-formatado seqüência (s) para iniciar uma sessão de análise GMRI. Cada seqüência de nucleotídeos neste formato deve ser precedido com uma única linha de partida com o caracter &quot;&gt;&quot; que representa um identificador, seguido na mesma linha por uma breve descrição dessa seqüência. Seqüências de nucleotídeos para análise GMRI também permite que personagens como R, Y, N, X, etc Hwever, não-A, T, C, G caracteres não serão processados ​​pelo programa e será ignorado. Seqüências em que os elementos repetitivos têm sido &quot;mascarados&quot; (substituído por &quot;N&quot; s) pode ser usado como entrada. Observe que os caracteres seqüência são case insensitive. <ol><li> Iniciar uma sessão GMRI clicando no &quot;iniciar ou retomar&quot; botão na página inicial Genomic MRI. Isso leva o usuário a uma página onde seqüências de nucleotídeos podem ser carregado. </li><li> Copie e cole o FASTA-formatado seqüências ou fazer upload de um arquivo contendo as seqüências de seu computador local usando a &quot;escolha o arquivo&quot; botão. </li><li> Clique no botão &quot;Iniciar sessão nova com este arquivo&quot; botão. Uma mensagem de confirmação deve aparecer acima da janela de entrada afirmando que &quot;Sua seqüência foi enviada com sucesso&quot; e você deve também ter uma alfanuméricos &quot;GMRI identificador&quot; [o site chama-lhe um &quot;rótulo sessão&quot;] para a sua sessão (por exemplo, b16yMj), que pode ser usado para recuperar e continuar a sessão por até duas semanas após a primeira utilização. </li></ol> NOTA: A partir de agora as seqüências de entrada são referidos como &quot;userfile&quot;. 3. Obter uma distribuição de freqüência de Oligonucleotídeos das Seqüências de Entrada (opcional). Clique no botão &quot;Analyzer SRI&quot; tab (linha superior), a fim de obter uma distribuição de freqüências de oligonucleotídeos para todo o conjunto de seqüências de entrada. A sigla SRI representa curto alcance não homogeneidade. Nesta conjuntura, o usuário pode especificar o comprimento máximo de oligonucleotídeos (de 2 até 9 nucleotídeos, padrão 6 nts) para os quais frequências serão calculados. Esta seleção é feita clicando na opção desejada dentro do &quot;Maximum oligômero tamanho&quot; caixa de listagem. Em seguida, pressione o botão &quot;Analyze File&quot; botão para iniciar a computação. Uma representação aproximada da composição seqüência de entrada será imediatamente aparecem como uma pequena tabela no meio desta página web e para download como &quot;userfile.comp.tbl&quot;. Esta tabela representa apenas os oligonucleotides mais e menos abundantes no seqüências de entrada. A tabela de freqüência inteira para todos oligonucleotides possível é gerado como um arquivo chamado &quot;userfile.comp&quot;, que pode ser obtido através do &quot;Download composição arquivo&quot; link. NOTA: SRI analisador conta todo o conjunto de todos os oligonucleotides sobrepostas. 4. Gerar seqüências aleatórias com a mesma composição de Oligonucleotídeos Como no seqüências de entrada (opcional). (Conclusão da etapa 3 do protocolo é necessário para esta tarefa). <ol><li> Clique em &quot;Gerador de SRI&quot; tab (fila de cima) para abrir uma nova página da web que cria seqüências aleatórias. Escolha o número de amostras de seqüências aleatórias a ser gerado usando a caixa de lista nesta página web. Cada um desses arquivos de exemplo conterá seqüências aleatórias do mesmo número e extensão, como as seqüências de entrada em &quot;userfile&quot;. Além disso, se uma seqüência de entrada contém caracteres não-A, T, C, G ou caracteres, a seqüência aleatória terá &quot;N&quot; s exatamente as mesmas posições que na seqüência de entrada. </li><li> Escolher o maior comprimento de oligonucleotídeos para os quais frequências serão aproximada em seqüências aleatórias. Isto pode ser escolhido por selecionando a opção para o nível desejado oligômero (por exemplo, &quot;4-mers&quot; por quatro-base oligonucleotides) na tabela no centro da tela. É de se notar aqui que as seqüências aleatórias consistirá não só as freqüências aproximadas ao nível oligômero escolhido, mas também as frequências correspondentes de níveis menores de oligômero, como nas seqüências de entrada. Pequenas flutuações na oligonucleotídeofreqüências de entrada e seqüências aleatórias são possíveis devido ao procedimento de Modelo Markov aplicados para a geração de seqüências aleatórias. </li><li> Inicie o programa clicando no botão &quot;Gerar Arquivo&quot; botão. Se as seqüências de entrada são grandes pode demorar alguns minutos para gerar seqüências aleatórias. Assim, um usuário deve esperar até que azul &quot;Download&quot; links aparecem na parte inferior desta página. Os conjuntos aleatórios são colocados em arquivos com nomes como &quot;userfile.randX_Y&quot;, onde X é o número do conjunto de forma aleatória e Y é o nível de oligômero escolhido (por exemplo, &quot;userfile_rand2_4&quot;). </li></ol> 5. Análise do Médio heterogeneidade (MRI) de entrada e seqüências aleatórias. <ol><li> Clique no botão &quot;MRI Analyzer&quot; guia (linha superior), que abre uma nova página da web que analisa a heterogeneidade de gama média da composição de nucleotídeos das seqüências. </li><li> Selecione uma seqüência a ser analisada a partir do &quot;File para analisar&quot; caixa de lista (uma escolha entre a seqüência de entrada e conjuntos de seqüências geradas aleatoriamente podem ser feitas aqui). </li><li> Escolha o tipo de conteúdo de ressonância magnética para ser analisado através da caixa de lista fornecida. (Sete opções de conteúdo estão disponíveis: G + C; G + A; G + T; A; G, C, ou T.) </li><li> Escolher o comprimento da janela para que as seqüências de conteúdo rico e pobre em conteúdo será analisado através do &quot;Window size&quot; caixa de listagem (o padrão é de 50 nucleotídeos, o intervalo válido é de 3-10). </li><li> Escolha o limite superior e limite inferior para as regiões ricas em conteúdo e conteúdo-pobres, respectivamente. Esses limites podem ser definidos pelo número exato de nucleotídeos em particular na janela atual (usando a opção número por na caixa de listagem) ou por porcentagem desses nucleotídeos na janela (usando a opção pelo percentual) </li><li> Depois de todas as cinco escolhas já foram feitas (por exemplo: Seqüência = &quot;userfile&quot;; Content = GC; tamanho da janela = 50; limite superior = 35; limite inferior = 15), chamar o programa, premindo o botão Analyze File. O programa varre todas as seqüências a partir da entrada selecionada consecutivamente. A cada passo que obtém um segmento da corrente de seqüência com comprimento igual ao tamanho da janela especificada e calcula se o número ou a percentagem de nucleotídeos do conteúdo escolhido estiver acima do limite superior ou abaixo do limiar inferior. Se a janela não corresponde nem critérios, a próxima janela sobrepostas (desviado por um nucleotídeo) é selecionado para a mesma análise. Quando uma janela é encontrada onde a seqüência de cumprir um dos requisitos de limite para conteúdo rico composição ou pobres, o programa salva a seqüência desta janela no arquivo de saída e gera um aumento na saída gráfica. Após isso, o programa salta para a janela não se sobrepõem próxima adjacentes e recomeça o processo de digitalização até o fim da seqüência seja alcançado. </li><li> Após a conclusão do programa, um link para o arquivo de saída (com o nome &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot; para o exemplo acima) aparece e uma representação gráfica dos resultados é exibido no meio da página web (veja Figura 1). Nesta apresentação gráfica todas as seqüências de entrada do userfile são concatenadas em uma única seqüência e apresentados como uma linha preta horizontal no eixo X, com comprimento em kilobases (kb) mostrado abaixo. Todas as regiões ricas em conteúdo ao longo de seqüências de entrada são marcados como azul &quot;para cima&quot; espigões, e conteúdo dos pobres regiões como o vermelho &quot;para baixo&quot; picos. O número total de janelas de conteúdo rico e conteúdo dos pobres são mostrados na parenthses na legenda na parte inferior desta figura (32 e 19, respectivamente). A figura serve para ilustrar a relativa abundância eo arranjo das regiões de ressonância magnética. Enquanto isso, os detalhes específicos são apresentados no arquivo de saída (ver Figura 3). Neste arquivo, todos os segmentos de seqüência de nucleotídeos que correspondem conteúdo rico ou pobre em critérios e suas coordenadas estão disponíveis para um usuário como uma lista de acordo com suas posições consecutivas ao longo do arquivo de entrada. </li><li> Após a conclusão da análise de MRI para a seqüência escolhido um usuário pode iniciar um novo processo na mesma página da web, fazendo mudanças nos parâmetros e / ou arquivos de entrada. Por exemplo, a fim de analisar a amostra aleatória gerada anteriormente # 1 com os mesmos parâmetros de ressonância magnética, o usuário só precisa mudar o arquivo de opção para analisar e selecionar o arquivo &quot;userfile_rand1_4&quot; e pressione o botão Arquivo Analisar novamente. Um novo arquivo e display gráfico irá substituir o antigo. Os resultados e os números de todos os exames em cada &quot;sessão lable&quot; (GMRI identificador) será salvo e estará disponível por duas semanas a partir da última atividade. A fim de salvar os resultados / figmentos de forma permanente, o usuário deve selecionar o &quot;Download Files&quot; guia (linha superior) e baixar a sessão inteira ou arquivos individuais, conforme necessário. </li><li> Com esta página web MRI Analyzer um usuário pode estudar <ul><li> (G + C) ricos e (A + T) regiões ricas </li><li> Purina (A G +)-ricos e pirimidina (C + T) regiões ricas </li><li> Keto (G + T) e rico em aminoácidos (A + C) regiões ricas </li><li> A-regiões ricas e pobres A- </li><li> G-regiões ricas e pobres G- </li><li> T-regiões ricas e pobres T- </li><li> C-ricos e pobres regiões C- </li></ul></li><li> A última versão do MRI Genomic tem uma nova opção para o estudo de regiões ricas em purinas (R) / Pirimidina (Y) padrões de alternância que pode formar Z-DNA conformações. Atualmente, essa opção está disponível no link &quot;Z-DNA&quot; e funciona na mesma base de outras regiões acima de ressonância magnética. Um usuário deve selecionar limiares superior e inferior para o número de (RY + YR) dinucleotídeos sobreposição na janela de digitalização. O programa produz uma saída semelhante gráfica e um arquivo de segmentos de DNA enriquecido e empobrecido por uma alternância de purinas e pirimidinas. O suposto Z DNA-regiões devem ser altamente enriquecido por uma alternância R / Y bases (ver revisão F &amp; F 2011). </li></ol> 6. Programas adicionais dentro do pacote Genomic MRI (opcional). O recurso Genomic RM também tem duas opções avançadas para a geração de muito específico seqüências aleatórias. Eles estão disponíveis através do &quot;Gerador de ressonância magnética&quot; e &quot;Generator CDS&quot; tabs na linha superior. <ol><li> Gerador de MRI cria sequências ao acaso, com a mesma composição de oligonucleotídeos como o arquivo de entrada (semelhante ao SRI gerador). No entanto, além disso, seqüências randomizado imitar um determinado padrão de ressonância magnética especificado pelo usuário. Dentro desta página web, o usuário deve especificar a partir de uma caixa de listagem um determinado padrão de ressonância magnética para ser imitado. A caixa de lista contém todos os padrões que foram examinados nesta sessão por MRI analisador (por exemplo, &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;). A seqüência aleatória gerada com esta opção terá a mesma composição de oligonucleotídeos como o arquivo de entrada selecionado e também o mesmo GC-ricos e dos pobres padrões como visto em &quot;userfile_GC_50_35 .. 15&quot;. </li><li> CDS gerador é usado para a randomização de sequências codificadoras de proteínas. Preserva a mesma seqüência de aminoácidos como a codificadas pela entrada especificado pelo usuário. Além disso, o programa mantém o mesmo códon e di-codon preconceitos, conforme especificado no usuário escolhido tabela de entrada. A versão online do gerador CDS também aceita uma seqüência de proteína como entrada. Todas as outras opções para o programa são oferecidas somente via stand-alone scripts Perl disponível para download a partir da página principal do web Genomic MRI. </li></ol> 7. Resultados representante Este protocolo permite que um usuário para estudar falta de homogeneidade de composição de seqüências de nucleotídeos. Importante, ele também suporta a geração de uma variedade de sequências ao acaso, com uma composição de oligonucleotídeos que se aproxima daquela das seqüências de entrada. Geralmente, as seqüências genômicas dos eucariotos complexos não são homogêneos em composição, mas representam um complexo mosaico de segmentos seqüência enriquecida por nucleotídeos particular (por exemplo, rica em purinas, (G + T)-ricos, (A + T), rico em etc.) Estes padrões de mid-range escala (3-10 pb) são visualizados através da saída gráfica do analisador de ressonância magnética que mostra selecionados conteúdo rico segmentos como superior picos de azul e de conteúdo pobre em segmentos como menores picos de vermelho (ver figuras 1 e 2). Normalmente, o número de todas as regiões ricas em conteúdo e conteúdo dos pobres em uma seqüência natural (Figura 1) é da ordem de vezes maior do que o número dos mesmos tipos de regiões em seqüências correspondentes ao acaso (Figura 2) com o oligonucleotídeo mesmo composição. Estes segmentos seqüência com mid-range heterogeneidade na composição de nucleotídeos podem ser de interesse para o usuário. Eles estão disponíveis a partir da Genomic arquivos de saída de ressonância magnética para investigação adicional. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um exemplo da saída analisador MRI gráfica a partir do passo 5.7. Os resultados foram obtidos em uma amostra de 44 introns humana. Barras azuis representam as posições de regiões ricas em GC ao longo destes íntrons. Barras vermelhas representam GC-pobre (ou AT-ricos) MRI regiões. O eixo y contém limiares superior e inferior para o tipo de conteúdo. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Analisador de saída MRI para a seqüência aleatória &quot;userfile.rand1_4&quot;. O graphical representação de ressonância magnética dentro de uma seqüência aleatória gerada utilizando o programa gerador de SRI. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Um exemplo do início de um arquivo de saída textual de analisador de ressonância magnética. Todas as seqüências de conteúdo rico e pobre de conteúdo detectado pelo programa são apresentados na coluna (quarto) passado. Suas posições relativas, medido em número de janelas, são mostrados na primeira coluna. A segunda e terceira colunas são indicadores para as regiões ricas em conteúdo e conteúdo-pobres, respectivamente.

<ol>
	<li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures.">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li><li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales.">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li><li>Fedorov, A., Fedorova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+An+Intricate+Mosaic+of+Genomic+Patterns+at+Mid-range+Scale.">Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale.</a> Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).</li><li>Shepard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+Binary-abstracted+Markov+models+and+their+application+to+sequence+classificatio.">Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio.</a> The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , 57-157 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Regiões com a composição de nucleotídeos não homogênea na mid-range escalas (3-10 nucleotídeos) são superabundantes nos genomas de eucariotos complexos e podem ser encontrados em qualquer lugar (regiões intergênicas, íntrons, as regiões não traduzidas dos exons, elementos repetitivos). Estas regiões são freqüentemente associados com conformações DNA incomum. Por exemplo, sequências purine-/pyrimidine-rich tendem a formar triplexes DNA (H-DNA); seqüências com a alternância de purina / pirimidina bases estão associados com Z-DNA conformações; (G + C) regiões ricas apresentam anormalidades estruturais no B- DNA e pode ser propenso a clivagem backbone; (A + T) regiões ricas podem formar uma estrutura incomum - um elemento DNA descontrair, etc (revisado por Fedorov &amp; Fedorova 2010). Alguns desses padrões de gama média (por exemplo, (G + T) regiões ricas) são mal investigados e ainda aguardam exploração completa e reconhecimento. O objetivo principal do nosso recurso web Genomic MRI é ajudar os usuários na identificação destas regiões RM para sua posterior análise experimental e para a exploração de suas possíveis funções. Conhecimento das regiões de ressonância magnética poderia ser incorporada e melhorar a nova geração de programas preditor gene (Shepard 2010) e avançar a nossa compreensão das funções do genoma e propriedades.

<ul><li> Computador com Internet </li><li> Arquivos com seqüências de nucleotídeos para exame. </li></ul>

genomic mri - a public resource for studying sequence patterns within genomic dna

Regiões não codificantes do genoma em eucariotos complexos, incluindo áreas intergênica, introns e exons segmentos não traduzida, são profundamente não-aleatórios em sua composição de nucleotídeos e consistem em um complexo mosaico de padrões de seqüência. Estes padrões incluem a chamada Faixa de Mid-homogeneidade (MRI) regiões - seqüências de 3-10 nucleotídeos de comprimento, que são enriquecidas por uma base ou combinação de bases (por exemplo, (G + T)-ricos, ricos em purinas, etc ). MRI regiões estão associadas com estruturas de DNA incomum (não-forma B) que muitas vezes são envolvidos na regulação da expressão gênica, recombinação, e outros processos genéticos (Fedorova &amp; Fedorov 2010). A existência de um viés de fixação forte dentro das regiões de ressonância magnética contra mutações que tendem a reduzir sua heterogeneidade seqüência adicionalmente suporta a funcionalidade e importância dessas sequências genômicas (Prakash et al. 2009). Aqui demonstramos um recurso Internet disponível gratuitamente - o pacote de programas Genomic MRI - (. Bechtel et al 2008) concebidos para a análise computacional de seqüências genômicas, a fim de encontrar e caracterizar vários padrões de ressonância magnética dentro deles. Este pacote também permite a geração de sequências ao acaso, com várias propriedades e nível de correspondência para as seqüências de DNA natural de entrada. O objetivo principal deste recurso é facilitar o exame das vastas regiões de DNA não-codificante que ainda são pouco investigados e aguardam exploração completa e reconhecimento.

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Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Apresentamos um sítio web público computacional para análise de seqüências genômicas. Ele detecta padrões de seqüência de DNA com vários não-aleatória composições de nucleotídeos. Este recurso também gera sequências ao acaso, com diversos níveis de complexidade.

Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K visualizações.  University of Toledo Health Science Campus. Apresentamos um sítio web público computacional para análise de seqüências genômicas. Ele detecta padrões de seqüência de DNA com vários não-aleatória composições de nucleotídeos. Este recurso também gera sequências ao acaso, com diversos níveis de complexidade.

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Biologia

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Um método prático e inovador para extrair DNA genômico de Kits de coleta de sangue para Preservação Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.