<p class="jove_title"> Coloração de secções de parafina </p><ol><li> Dewax slides com xileno (Fisher X3 <sup>S</sup> -4) 3x por 5 minutos cada (xileno mudam a cada mês, dependendo do uso, xileno é tóxico). Use pratos e tampas para 20 slides de Fisher ref 08-812-1A e racks feito para caber esses pratos. 200 ml de líquido por prato. </li><li> Hidratar por meio de gradiente de álcool da seguinte forma (mudança de gradiente a cada 2 semanas): <ul><li> 2x em etanol 100% (Fisher # A406-20) por 2 min cada </li><li> 2x em etanol 95% por 2 min cada </li><li> 1x em etanol 70% por 2 min </li><li> 1x em etanol 50% por 2 min </li><li> 1x em etanol 30% por 2 min </li><li> 1x DDH <sub>2</sub> O por 2 min </li></ul></li><li> Mergulhe na DPBS por 5 min (DPBS = fosfato modificado Dulbecco Buffered Saline com Ca <sup>2 +</sup> e Mg <sup>2 +).</sup> </li></ol><p class="jove_title"> Recuperação do antígeno: </p><ol><li> Pré-aqueça o tampão a Na-Citrato (10 mM, pH 6,5) no microondas. </li><li> Cozinhe as lâminas durante 15 min no microondas. Os slides não devem secar para verificar cada min e adicionar Na-Citrato, quando necessário. </li><li> Deixe esfriar em temperatura ambiente. </li><li> Bloquear a atividade da peroxidase endógena com 1% de H <sub>2</sub> O <sub>2</sub> em DPBS por 20 min (1,5 ml de estoque 30% Sigma H-1009 em 50 DPBS ml). </li><li> Mergulhe na DPBS 3 x 5 min. </li><li> Bloco non-sites específicos por incubação durante a noite a 4 ° C em DPBS + 5% de albumina sérica bovina (BSA) + 0,1% Na Azida + 5% de soro. <em><br /></em> <br /> Nota: A escolha de soro irá depender da espécie em que os anticorpos utilizados para a coloração foram feitas. Bloco com soro de espécies em que o Ab secundário (conjugado com biotina) foi feita. Se este não estiver disponível, use soro de uma espécie diferente daquele em que o Ab primário foi feito. <br /> <em><br /></em> </li><li> Bloquear os sites com a biotina avidina / biotina bloqueio kit (Vector laboratórios de catalogo SP-2001): <ul><li> Incube com Avidin D por 15 min. Lave brevemente com DPBS. </li><li> Incube com a solução de biotina por 15 min. </li></ul></li><li> Incubar em Ab primário para 2 horas em temperatura ambiente, em DPBS + 2% BSA NaAzide + 0,1% + 2% de soro (o mesmo que para Bloqueio de passo). </li><li> Mergulhe em PBS 3 x 5 min. </li><li> Incube com a Ab secundário conjugado com biotina por 1 hora em temperatura ambiente + 2% + 0,1% BSA Na Azida + 2% de soro (mesmo utilizado para a etapa de bloqueio). DPBS em </li><li> Preparar o reagente ABC, ao mesmo tempo porque tem que desenvolver para pelo menos 30 min antes de usar! (Veja Materiais) </li><li> Prepare em um tubo de 50 ml. Em 15 DPBS ml (sem soro, sem azida) adicionar 3 gotas do reagente A, misturar e adicionar 3 gotas de reagente B e misturar. Evite apertar as garrafas, e não esperar que as gotas para formar por conta própria. ABC kit Vectastain PK-6100 da Vector Labs. </li><li> Mergulhe na DPBS 3 x 5 min. </li><li> Incube com reagente ABC por 30-45 min em temperatura ambiente. </li><li> Mergulhe na DPBS 3 x 5 min. </li><li> Prepare DAB substrato peroxidase (Vector Labs # SK-4100) em 5 ml DDH <sub>2</sub> O num frasco de vidro <strong>imediatamente antes do uso</strong> (ver Materiais) <ul><li> 2 gotas de solução de estoque regulador, mix </li><li> 4 gotas de DAB, mix (deve ficar ligeiramente marrom) </li><li> 2 gotas H <sub>2</sub> O <sub>2,</sub> mix </li></ul></li><li> Soltar o substrato DAB em cima dos slides e assistir a coloração marrom. </li><li> Dip slides em gelo + água da torneira para parar a reação. </li><li> Enxágüe em água corrente fria por 5 min. </li><li> Contracoloração com hematoxilina (20 seg; Fisher CS401-D) e enxaguar em água corrente até que a água sai clara. </li><li> Desidratar através de gradiente de álcool a partir de etanol 30% até 100% de etanol (2 min cada). </li><li> Mergulhe em xileno 3 x 5 min. </li><li> Montagem com Permount (Fisher # SP15-100): ponha algumas acima a seção sobre o slide e pressione lentamente para a seção com uma lamela, sem bolhas de ar. Não mova a lamela até que esteja completamente seco, o que leva ~ 24 horas. </li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>X3S-4</td>
<td>Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.</td>
</tr>
<tr>
<td>100% ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A406-20</td>
<td>Use to make EtOH gradient.</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Na-Citrate buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM, pH 6.5</td>
</tr>
<tr>
<td>H2O2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-1009</td>
<td>30% stock => Dilute to 1% in DPBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Blocking solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. </td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NaAzide</td>
</tr>
<tr>
<td>avidin/biotin blocking kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector laboratories</td>
<td>SP-2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ab buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPBS + 2% BSA +  0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)</td>
</tr>
<tr>
<td>ABC kit Vectastain PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB peroxidase substrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SK-4100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ddH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hematoxylin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>CS401-D</td>
<td>counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Permount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SP15-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slides and cover-slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunohistochemistry: paraffin sections using the vectastain abc kit from vector labs

<p class="jove_content">Imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica valiosa utilizada para localizar / visualizar a expressão da proteína em uma seção de tecido montado usando anticorpos específicos. Existem dois métodos: o método direto e indireto. Neste experimento, vamos apenas descrever o uso de coloração IHQ indiretos. Coloração IHC indireta utiliza altamente específicos primário e biotina conjugado com anticorpos secundários. Anticorpos primários são utilizados para identificar discretamente proteínas de interesse por ligação a um epítopo específico, enquanto anticorpos secundários subtrair para não-específica coloração de fundo e amplificar o sinal através da formação de complexos com o anticorpo primário. Slides podem ser gerados a partir de cortes congelados, ou parafina incorporada montados em lâminas de vidro. Neste protocolo, discutimos a preparação de parafina seções por hidratação desparafinação, usando um gradiente de álcool, a recuperação de calor antígeno induzido, e bloqueio da atividade da peroxidase endógena e não-específicas sítios de ligação. Algumas seções são então coradas com anticorpos específicos para T CD8 e marcador de células, enquanto outras estão manchadas de tirosina hidroxilase. Os slides são posteriormente tratados com anticorpos secundários conjugados apropriado para biotina, então desenvolvido utilizando conjugado avidina-peroxidase (HRP) com Diaminiobenzidine (DAB) como substrato. Na sequência do desenvolvimento, as lâminas são contracorados de contraste e montado sob lamínulas com Permount. Após a secagem adequada, estes slides estão prontas para a imagem latente.</p>

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Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Imuno-histoquímica: Seções de parafina Usando o Kit de Vectastain ABC Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

immunohistochemistry-paraffin-sections-using-vectastain-abc-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

69.2K visualizações.  University of California, Irvine (UCI). 