<p class="jove_content"&gt; Os autores gostariam de agradecer a Jennifer Strange e Greg Bauman para a sua assistência com a análise de Citometria de Fluxo e classificação. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant Número 2P20 RR020171 do NCRR e pela Universidade de Kentucky fundos de inicialização para FM; GIE agradece o apoio da Sociedade de Pós-Graduação Presidencial e da Irmandade Opportunity Kentucky.</p

1. Isolamento de Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de Buffy Coat <ol><li> Adquirir uma unidade de revestimento buffy do hospital ou centro de localização nas proximidades de sangue. Nosso centro de sangue nos fornece cerca de 40-60 mL de buffy coat por unidade obtido a partir de doadores de sangue normais. </li><li> Derrame sangue em uma garrafa de vidro esterilizada contendo 500 mL PBS estéril para diluir buffy coat. O volume final de PBS + buffy coat deve ser de 250 mL. </li><li> Encha dez 50 mL tubos cónicos cada uma com 20 mL solução de Lymphoprep. </li><li> Suavemente sobrepor a solução Lymphoprep com 25 mL de buffy coat diluída, tendo cuidado para não perturbar a solução Lymphoprep. </li><li> Girar tubos durante 30 minutos à temperatura ambiente a 500 x g. Assegure-se para desligar o freio de centrífuga, de modo a não perturbar a fracção de linfócitos. </li><li> Recolher as PBMCs na interface entre o Lymphoprep e as camadas de plasma médio com uma pipeta. Aspirar o off plasma médio até cerca de 1 mLainda cobre a camada de buffy coat contendo as CMSPs. Usar uma pipeta 10 mL de transferir para um tubo de PBMCs mL novo 50. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS e em seguida, ressuspender as células em 50 mL de RPMI frio para contagem num hemocitómetro. Recuperação típica é de 8 x 10 8 - 1 x 10 9 PBMCs. </li></ol> Este procedimento pode ser reduzida para pequenos volumes de sangue. A diluição das amostras de sangue total é de 1:1 em PBS. 2. Seleção Negativa magnética de células CD4 + Total de células T, CD4 + CD45RA células T naive ou CD4 + CD45RO + células T de memória de PBMCs utilizando Kits de enriquecimento EasySep (células-tronco Technologies) Passos a seguir para 1 x 10 8 a 4,25 x 10 8 PBMCs. <ol><li> PBMCs Ressuspender a uma concentração final de 5 x 10 7 por mL em PBS contendo 2% de FBS e 1 mM de EDTA. Mover células para a 14 mL de polipropileno novo tubo de fundo redondo. <ol class = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> Isolamento do total de células CD4 + de células T humanas por selecção negativa: adicionar T CD4 + humanas de cocktail de Enriquecimento Célula de anticorpos (50 uL por mL de PBMCs), misturar e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Isolamento de células T humanas naive por selecção negativa: adicionar 50 ul de anti-CD45RO anticorpo por mL de suspensão de células PBMC, misturar e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicionar cocktail de enriquecimento fornecido com o kit (50 uL de por mL de PBMCs), misturar e incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Isolamento de células T humanas de memória por selecção negativa: adicionar CD4 + humanas de memória T Cocktail Enriquecimento Célula de anticorpos (50 uL por mL de PBMCs), misturar e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Misture bem para partículas magnéticas igualmente distribuí-los em toda a solução. Faça nanopartículas não vórtice de kit ingênuo. </li><li> Adicionar as partículas magnéticas (100 uL por mL de PBMCs para CD4 + totais e selecção de células T ingénuos, 50 uL por mL de PBMCs para a memória de selecção de células T). Mix com cuidado pipetando 2-3 vezes e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para a selecção de células T naïve ou 5 minutos de memória ou total T CD4 + de seleção de célula. </li><li> Adicionar PBS contendo 2% de FBS e 1 mM de EDTA para levar o volume até 10 mL por tubo. Misture com cuidado pipetando 2-3 vezes antes de colocar tubo sem tampa em prata ímã EasySep para 5, 10 ou 2,5 minutos para CD4 total de células T, subconjuntos ingênuos e memória, respectivamente. </li><li> Com tubo ainda no ímã EasySep, despeje o líquido em novo tubo de 50 ml para isolar as células de interesse. </li><li> Repita os passos 2.5 e 2.6 para uma melhor recuperação. </li></ol> 3. Condições de cultura celular para induzir as células T reguladoras <ol><li> Um dia antes passos 1 e 2, o revestimento placas de cultura de tecidos por primeira diluição anticorpo anti-CD3 (OKT3 clone) a uma concentração de 1 ug / mL em PBS estéril. Para uma placa de 6 poços adicionar 2 mL de PBS + anti-CD3 por poço, para uma placa de 12 poços adicionar 1 mL ou para uma placa de 24 poços adicionar 500 uL por poço. Manter a placa revestida a 4 ° C até à utilização. </li><li> Preparar meio de polarização através da adição de 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL e 50 uM β-mercaptoetanol para RPMI-1640 pré-suplementado com 2,06 mM mM Glutamax-I e 25 tampão HEPES. Em seguida, adicionar 2 ng / mL de TGF-β e 5 ng / mL de IL-2. Aqui, pode-se adicionar ligantes ou inibidores de interesse para a mídia. Ressuspender as células a partir do passo 2, a uma concentração de 2 x 10 6 células / ml de meio de polarização. </li><li> Pré-aquecer as placas a 37 ° C e aspirar o PBS de anti-CD3 poços revestidos antes de adicionar as células. Adicionar 4 mL por poço de suspensão de células para uma placa de 6 poços, 2 mL de células para uma placa de 12 poços ou 1 mL de células para uma placa de 24 bem. Encha poços vazios com PBS para reduzir a evaporação demeios de comunicação. Incubar durante 3 dias a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> No dia 3 pós de revestimento, girar para baixo da placa numa centrífuga durante 5 minutos a 500 x g. Sem perturbar as células T na parte inferior da placa, remover metade dos meios de comunicação e substituir com meios frescos. Alternativamente, se o bem torna-se cheia com células (concentração acima de 3 x 10 6 / mL), dividir o volume igualmente em outra placa de anti-CD3 revestido e adicionar meios frescos para trás até ao volume original. Incubar durante dois a três dias mais a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> 4. Fluorescência-activated cell sorting (FACS) de três populações de células T <ol><li> Preparar tampão de lavagem de FACS pela adição de 0,5% (w / v) de albumina sérica bovina (BSA) e 2 mM de EDTA para PBS estéril. Tampão a 4 ° C para obter a frio. </li><li> Remover as células de cultura de células bem e enxaguar cada poço com 2 mL de PBS para assegurar a recuperação completa das células. Coloque todas as células em 50 tubos de polipropileno mL e centrifugar a 500 xg durante 10minutos a 4 ° C. </li><li> Contar as células em um hemocitómetro para determinar a densidade celular. </li><li> O local de 3-5 x 10 células por tubo 5 em quatro separadas 5 mL tubos de fundo redondo de poliestireno para os controlos de compensação. Coloque células restantes em tubos de 50 ml de polipropileno, não mais do que 35 x 10 6 células por tubo. </li><li> Girar para baixo células durante 5 minutos a 4 ° C e meios de comunicação aspirado. Ressuspender as células a serem classificados em 90 uL de tampão de lavagem fria por 1 x 10 6 células. Ressuspender em 100 L de tampão de lavagem a frio dos tubos de controle de compensação. </li><li> Para as células a ser ordenados, combinar 2 uL de anti-CD25-PE, 3 uL de anti-CD45RA-PE-Cy5 e 1 uL de anti-CD127-APC por 1 x 10 6 células. Adicionar nenhum anticorpo para o primeiro tubo de compensação de controlo, 2 uL de anti-CD25-PE para o segundo tubo, 3 uL de anti-CD45RA - PE-Cy5 ao terceiro tubo uL de anti-e1 CD127-APC para o tubo de quarto. Incubar todos os tubos em gelo durante 45 minutos no escuro. </li><li&gt; Adicionar 10 mL de tampão de lavagem a frio para as células a ser ordenados e 1 ml para os tubos de controlo de compensação. Centrifugar todos os células a 500 xg durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspirar células tampão e ressuspender a uma concentração de 1 x 10 células por 7 mL de tampão de lavagem. Adicionar 1,5 ul de DNase II por mL de células antes de filtrar através de um coador de 40 uM de células de nylon. Mover as células a várias 5 mL redondos tubos de polipropileno de fundo com não mais do que 3,5 mL por tubo. Ressuspender as células controle de compensação em 300 uL de tampão de lavagem. </li><li> Defina a compensação em MoFlo citômetro de fluxo para minimizar a detecção cruzada pela, PE APC e PE-Cy5 filtros. Definir portas para classificar iTregs (CD25 CD127 Hi -/LOW CD45RA - células), virgens (CD25-CD45RA +) e memória (CD25 - CD45RA -) células T em 5 mL tubos de fundo redondo de isopor contendo 1 mL soro de bezerro recém-nascido. </li></ol> 5. Ensaio de supressão <ol><li> Faça SUPPRession meio de ensaio por adição de 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, 5 ng / mL de IL-2 e 2 ng / mL de TGF-β ao AIM-V. </li><li> No dia do ensaio, purificar CD4 + de células T heterólogas a partir de buffy coat, como indicado nos passos 1 e 2. Estas serão as células alvo para o ensaio de supressão e não contém células CD25 + Treg, como pode ser visto na Figura 2, dia 0. </li><li> Células de etiqueta com CellTrace kit como as instruções do fabricante, excepto utilizando apenas 1 ul de solução-mãe 5 mM por mL de células, em vez de 2 uL. Mantendo fora da luz directa, adicionar 18 uL de DMSO a fornecida pelo kit CellTrace para um frasco de CFSE para fazer uma solução estoque de 5 mM. Ressuspender o número necessário de células alvo (até um máximo de 1 x 10 7) em pré-aquecido PBS + 0,1% (w / v) de BSA para uma concentração final de 1 x 10 6 células / ml. Adicionar 1 mL de 5 mM CFSE por mL de células e incubar em um banho de água 37 ° C durante 5 minutes. Adicionar 5 volumes de completa, gelada RPMI com FBS 10% para extinguir a coloração e incubar em gelo durante 5 minutos. Lave as células duas vezes mais com frio RPMI completo e ressuspender 1 x 10 células por 5 100 uL de meio de ensaio de supressão. </li><li> Grânulos inspector Treg supressão são a uma concentração stock de 2 x 10 7 grânulos / mL. Pellet um número de pérolas igual ao número total de células por experimento por centrifugação rápida em um tubo de Eppendorf. Lavar uma vez com RPMI grânulos e re-sedimento. Após a aspiração de RPMI, grânulos Ressuspenda de modo que a quantidade apropriada de grânulos por poço estão em 8 uL de meio de ensaio de supressão. </li><li> Para uma placa de fundo redondo bem 96 cultura de tecidos, adicionar CFSE coradas células (1 x 10 5 células / mL), grânulos de inspector e células polarizadas e ordenadas (1 x 10 5 células / mL) em meio de ensaio fresco de supressão de um alvo desejado (manchado CFSE): razão (ordenadas) efectora em um volume final de 200 uL. Todas as condições são definidas em tripliCates. </li><li> Preparar a primeira de duas condições de controlo por adição de 100 uL de células coradas CFSE, 8 uL de pérolas de inspector e 1 x 10 5 de fresco, de células não coradas em 92 uL de meio de ensaio supressor por poço. Preparar o segundo controlo com os mesmos componentes celulares, como acima, mas sem Tregs grânulos inspector. </li><li> Cobrir a placa em folha de alumínio e incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante cinco dias. </li><li> No escuro, colete células de cada poço por pipetagem e coloque em um tubo de 5 mL de poliestireno de fundo redondo. Centrifugar células a 500 xg durante 5 minutos a 4 ° C, aspirado meios, e ressuspender em 300 ul de FACS frio tampão de lavagem a partir do passo 4. Analisar o primeiro 3 x 10 4 CFSE + eventos ao vivo a partir do portão de linfócitos representando as células-alvo em um histograma com software da Quest Cell. </li></ol> 6. Os resultados representativos Exemplo de pseudo de citometria de fluxo pontilham parcelas ao longo de um tempo de cinco dias-coudiferenciação iTreg rse monitorização com base na relação co-expressão de CD25 com FoxP3, CTLA-4 e CD45RA pode ser visto na Figura 2. O histograma na Figura 3 mostra um ensaio de supressão sucesso, em que ordenadas iTregs (CD25 Hi CD45RA - CD127 células -/LOW). São apenas o subconjunto de uma cultura de cinco dias, que adquiriu capacidade reguladora / supressor A Figura 4 mostra a indução de Tregs a partir de uma piscina ingénuo de células T (painéis superiores) e uma memória de pool de células T (painéis inferiores), após cinco dias de cultura em meio de iTreg padrão. CFSE coloração de células iniciais demonstram que tanto as células T naive (painel superior direito) ou memória (painel inferior direito) para diferenciar iTregs (mais FoxP3-células que expressam) somente após várias rodadas de divisão celular. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do procedimento experimental. PBMCs are separados do sangue periférico humano através de centrifugação de gradiente de antes da seleção negativa magnética de células CD4 + CD25 - células T. Depois de cinco a seis dias em cultura, as células submetidas FACS e são co-incubados com heterólogos CFSE células alvo marcadas para medir a actividade supressora. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> A Figura 2 humana purificada CD4 + primárias CD25 -. Células T são cultivadas em meio iTreg. Uma alíquota de células são recolhidas apenas depois do isolamento (dia 0) e nos dias 1, 3 e 5 de cultura de células para monitorizar o progresso de CD45RA, FoxP3, CTLA-4 e CD25 marcadores. O perfil corresponde a iTreg CD45RA -, FoxP3 Hi, Hi CTLA-4 e CD25 Hi (em destaque na janela de gráfico). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> Figura 3. Purificada CD4 + CFSE lacélulas Beled (1 x 10 5 / poço) são cultivadas com Tregs grânulos inspector de supressão, na presença de ordenados células de memória, ou ingénuo iTreg (3 x 10 4 / poço). Após cinco dias, as células são colhidas e do perfil de CFSE das células coradas é analisada por citometria de fluxo. A presença de células iTreg completamente abolida a proliferação de células T CD4 +. Os números são indicativos de percentagem de células CFSE-rotulados que tenham sido submetidos a divisão. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> Figura 4 purificada humana primária ingênuo. (CD4 + CD25 - CD45RA +) e memória (CD4 + CD25 - CD45RO +) células T são corados com CFSE e cultivadas em iTreg médio. Após cinco dias, as células são fenotipado e as taxas de divisão celular estimado. Como indicado na Figura 2, o subconjunto iTreg diferenciados a partir de ambos os subconjuntos corresponde àCD45RA - CD25 FoxP3 Hi Hi e CTLA-4 Hi (dois últimos não mostrado). Perfis de coloração comparativos CFSE identificar iTregs (aqui como mais elevados nas células que expressam Foxp3 T) como as células mais proliferativas durante a cultura de cinco dias.

<ol>
	<li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4++T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity.">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li><li>Tarbell, K. 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Os autores não têm nada a revelar.

Enquanto a transferência Treg promissora terapêutico no combate enorme rejeição do enxerto autoimunidade e outras desordens imunitárias ou inflamatórias mediadas, métodos para a sua geração eficiente e manutenção estável ainda não tenham sido desenvolvidos. Como apenas 1-5% de circulação de células T humanas são Tregs, a sua expansão controlada e diferenciação supera esta escassez como um impedimento principal da aplicação de Tregs na clínica. Por outro lado, como aprendemos com o julgamento TGN14...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Manter a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> Centrífuga de bancadas refrigerado </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Brilhante-Line hemocitômetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> CD4 + T EasySep Humanos Kit Enriquecimento celular </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Humanos da Memória + T CD4 Kit Enriquecimento celular </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Humanos CD4 + T Naïve Kit Enriquecimento celular </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> The Big Easy EasySep Magrede </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 18001 </td><td> Prata </td></tr><tr><td> 5 mL tubos de poliestireno de fundo redondo </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de centrífuga tubos de polipropileno </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 mL de polipropileno de fundo redondo Tubos </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml de centrífuga tubos de polipropileno </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-CD3 humano </td><td> Cell Bio X </td><td> BE0001-2 </td><td> Clone: ​​OKT3 </td></tr><tr><td> 24 Bem celular placa de cultura de poliestireno </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 Bem fundo redondo placa de cultura de tecidos </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 com Glutamax-I e tampão HEPES </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Soro fetal de bovino (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinante Humana TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Human IL-2 recombinante </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Rato anti-humano CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Clone: ​​4E3 </td></tr><tr><td> Rato anti-humano CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Clone: ​​HI100 </td></tr><tr><td> Rato anti-humano CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Clone: ​​MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNase II </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo citómetro de fluxo </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Software </td><td> Árvore Star, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Célula Quest Software Pro </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Recém-nascido Calf Serum </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CFSE CellTrace Kit Proliferação de Células </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg Contas Inspetor de Supressão </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 estirpe celular iM Nyloner </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

O desenvolvimento e manutenção das células T CD4 + de imunossupressores células T reguladoras (Tregs) contribuem para a tolerância periférica necessária para permanecer na homeostase imunológica com a grande quantidade de antigénios próprios e comensais e no corpo humano. Perturbações no equilíbrio entre Tregs e inflamatórias células T convencionais podem resultar em imunopatologia ou cancro. Embora a injecção terapêutica de Tregs foi mostrado para ser eficaz em modelos murinos de colite 1, diabetes tipo I 2, artrite reumatóide e doença do enxerto versus hospedeiro, 4 várias diferenças fundamentais em humanos versus rato Treg biologia 5 tem, até agora impedida a utilização clínica. A falta de um número suficiente, pureza, estabilidade e especificidade de homing terapêutico Tregs exigiu uma plataforma dinâmica do desenvolvimento Treg humana em que para optimizar as condições para a sua expansão ex vivo 6. Aqui nós Dcircunscrever um método para a diferenciação de induzida Tregs (iTregs) a partir de um único dador de sangue periférico humano, que pode ser dividido em quatro etapas: isolamento de células mononucleares do sangue periférico, a selecção magnética de células T CD4 +, em cultura celular in vitro e fluorescência activado separação de células (FACS) de subconjuntos de células T. Uma vez que o factor de transcrição Treg assinatura P3 caixa forkhead (FoxP3) é um factor de transcrição induzida por activação em seres humanos 7 e sem outros marcadores únicos existe, um painel de combinatória de marcadores, deve ser utilizado para identificar as células T com actividade supressora. Depois de seis dias em cultura, as células no nosso sistema pode ser demarcada em naive células T, células T de memória ou iTregs com base na sua expressão relativa de CD25 e CD45RA. Como as células T de memória e naïve têm diferentes requisitos de polarização relatados e plasticidades 8, pré-triagem da população inicial de células T em CD45RA + e CD45RO + subconjuntos pode be usado para examinar essas discrepâncias. Consistente com os outros, nossa CD25 Hi CD45RA - níveis elevados de iTregs expressas FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e baixos níveis de CD127 12. Na sequência de FACS de cada população, as células resultantes podem ser utilizados num ensaio de supressor que avalia a capacidade relativa para retardar a proliferação de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-rotulado células T autólogas.

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K visualizações.  University of Kentucky. Nós descrevemos um método para a geração de células T de memória, regulamentar e ingénuos a partir de um único dador de sangue humano. Tregs polarizada pode ser então comparada com outros subconjuntos de uma variedade de aplicações genéticas e funcionais com homogeneidade genética, incluindo um ensaio de supressão também detalhados aqui.

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Imunologia e Infecção

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivação de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

As células T Capturar Bactérias por Transinfection das dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.