1. Preparação do Gel <ol><li> Pesar a massa adequada de agarose em um balão de Erlenmeyer. Géis de agarose são preparadas utilizando aw / v solução percentagem. A concentração de agarose num gel dependerá dos tamanhos dos fragmentos de ADN a ser separado, com a maioria dos géis que variam entre 0,5% -2%. O volume do tampão não deve ser maior do que 1/3 da capacidade do balão. </li><li> Adicionar tampão de corrida para o balão de agarose contendo. Agite para misturar. O gel mais comum em execução buffers são TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Derreta a mistura de agarose / buffer. Esta é mais comumente feito por aquecimento em microondas, mas também pode ser feito ao longo de uma chama de Bunsen. Em intervalos de 30 s, retirar o balão e agite o conteúdo para misturar bem. Repita até que a agarose foi completamente dissolvido. </li><li> Adicionar brometo de etídio (EtBr) a uma concentração de 0,5 ug / ml. Alternativamente, o gel pode também ser coradas após electroforese em tampão de corrida contendo 0,5 ug / ml para EtBr 15-30 min, seguido de descoloração em tampão de corrida para um comprimento igual de tempo. </li></ol> Nota: EtBr é suspeito de ser carcinogênico e devem ser eliminadas de acordo com as normas da instituição. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis contendo EtBr. Corantes alternativos para a coloração do ADN estão disponíveis, no entanto EtBr continua a ser a mais popular devido à sua sensibilidade e custo. <ol start="5"><li> Permitir que a agarose para arrefecer tanto na bancada ou por incubação em um banho de água 65 ° C. Não fazer isso irá deformar a bandeja de gel. </li><li> Coloque o tabuleiro de gel dentro do aparelho de fundição. Alternativamente, pode-se também fita as extremidades abertas de um tabuleiro de gel para criar um molde. Coloque um pente apropriado para dentro do molde de gel para criar os poços. </li><li> Verter a agarose fundida no molde de gel. Permitir que a agarose para definir a temperatura ambiente. Remover o pente e colocar o gel na caixa de gel. Alternativamente, o gel também pode ser envolto em película de plástico e armazenado a 4 ° C até à sua utilização (Fig. 1). </li></ol> 2. Criação de Aparelhos Gel e separação dos fragmentos de DNA <ol><li> Adicionar carregamento corante para as amostras de DNA a ser separada (fig. 2). Carga de gel de corante é tipicamente feito a uma concentração 6X (0,25% azul de bromofenol, xilenocianol a 0,25%, 30% de glicerol). Carregando tintura ajuda a controlar o quanto sua amostra de DNA viajou, e também permite que a amostra afundar no gel. </li><li> Programa oferta o poder de tensão desejada (1-5V/cm entre os eletrodos). </li><li> Adicionar tampão de corrida suficiente para cobrir a superfície do gel. É importante usar o mesmo tampão executado como o utilizado para preparar o gel. </li><li> Ligue os fios da caixa de gel para o fornecimento de energia. Ligue a fonte de alimentação e verificar que tanto a caixa de gel e fonte de alimentação estão funcionando. </li><li> Remover a tampa. Lentamentee cuidadosamente carregar a amostra de DNA (s) para dentro do gel (Fig. 3). Um marcador de tamanho apropriado de DNA devem sempre ser carregado juntamente com amostras experimentais. </li><li> Colocar a tampa para a caixa de gel. O cátodo (fios pretos) deve estar mais perto dos poços do que o ânodo (pistas vermelhas). Verifique se os eletrodos estão conectados nos slots corretos no fornecimento de energia. </li><li> Ligue a alimentação. Executar o gel até o corante tenha migrado para uma distância apropriada. </li></ol> 3. Observando fragmentos de DNA separados <ol><li> Quando eletroforese foi concluído, desligue a fonte de alimentação e retire a tampa da caixa de gel. </li><li> Remover gel a partir da caixa de gel. Drenar o tampão em excesso a partir da superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em papel toalha para absorver qualquer buffer extra em execução. </li><li> Remover o gel a partir do tabuleiro de gel e expõe o gel à luz UV. Esta é mais comumente feito usando um sistema de documentação gel (Fig. 4). Bandas de DNA deve mostraracima como laranja bandas fluorescentes. Tire uma foto do gel (Fig. 5). </li><li> Descarte a gel e tampão de corrida por regulamentos da instituição. </li></ol> 4. Os resultados representativos A Figura 5 representa um resultado típico após electroforese em gel de agarose de produtos de PCR. Após a separação, os fragmentos de DNA resultantes são visíveis como bandas claramente definidos. O padrão de ADN ou de escada devem ser separados a um grau que permite a determinação útil dos tamanhos das bandas da amostra. No exemplo mostrado, fragmentos de DNA de 765 pb, 880 pb e 1022 pb foram separados num gel de agarose a 1,5%, juntamente com uma escada de DNA 2-log. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figura 1. Um solidificou em gel de agarose após a remoção do pente. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figura 2. Um estudante adicionando corante de carregamento para as amostras de DNA. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figura 3. Um estudante carregamento da amostra de DNA dentro de um poço no gel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figura 4. Um exemplo de um sistema de documentação de gel. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figura 5. Uma imagem de uma electroforese em gel de pós. EtBr foi adicionado ao gel antes de electroforese para uma concentração final de 0,5 ug / ml, seguido de separação a 100 V durante 1 hora. O gel foi exposto a luz UV e da fotografia tirada com um sistema de documentação de gel.

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Electroforese em gel de agarose provou ser um modo eficiente e eficaz de separar ácidos nucleicos. Força de agarose de gel de alta permite a manipulação de géis percentuais de baixo custo para a separação de fragmentos de ADN de grande porte. Peneiração molecular é determinado pelo tamanho dos poros gerados pelos feixes de agarose 7 na matriz de gel. Em geral, quanto maior a concentração de agarose, quanto menor o tamanho dos poros. Géis de agarose tradicionais são mais eficazes na separação de fragmentos de ADN entre 100 bp e 25 kb. Para separar fragmentos de ADN maiores do que 25 kb, uma será necessário usar pulso electroforese em gel de campo 6, que envolve a aplicação de corrente alternada a partir de duas direcções diferentes. Deste modo maiores fragmentos de DNA são separados por tamanho a velocidade a que eles reorientar-se com as mudanças na direcção da corrente. Os fragmentos de DNA mais pequenos do que 100 pb são mais eficazmente separados usando electroforese em gel de poliacrilamida. Ao contráriogéis de agarose, a matriz de gel de poliacrilamida é formada através de uma reacção química de radical livre accionado. Estes géis são mais finas de maior concentração, são executados na vertical e tem uma melhor resolução. No DNA moderna sequenciação electroforese capilar é usado, em que tubos capilares são preenchidos com uma matriz de gel. A utilização de tubos capilares permite a aplicação de tensões elevadas, permitindo assim a separação de fragmentos de DNA (e à determinação da sequência de ADN) rapidamente. Agarose pode ser modificada para criar baixo ponto de fusão de agarose através hydroxyethylation. Baixo ponto de fusão de agarose é geralmente usado quando o isolamento de fragmentos de DNA separados é desejada. Hydroxyethylation reduz a densidade de empacotamento dos feixes de agarose, reduzindo efectivamente o seu tamanho de poro 8. Isto significa que um fragmento de ADN do mesmo tamanho levará mais tempo para se mover através de um baixo ponto de fusão gel de agarose em oposição a um gel de agarose padrão. Porque os feixes associar com um outroatravés de interacções não covalentes 9, é possível re-derreter gel de agarose um depois de ter definido. EtBr é o reagente mais comum utilizado para corar o DNA em géis de agarose a 10. Quando exposta à luz UV, os electrões no anel aromático da molécula de etídio são activadas, o que leva à libertação de energia (luz) como o retorno electrões para estado fundamental. EtBr funciona por intercalando-se na molécula de ADN de uma forma dependente da concentração. Isto permite a uma estimativa da quantidade de DNA em qualquer banda de DNA particular com base na sua intensidade. Devido à sua carga positiva, o uso de EtBr reduz a taxa de migração de DNA em 15%. EtBr é um agente mutagênico e carcinogênico suspeito, portanto é preciso cuidado ao manusear géis de agarose que o contenham. Além disso, é considerado um EtBr resíduos perigosos e devem ser eliminados de forma adequada. Manchas alternativos para DNA em gel de agarose incluem SYBR Gold, SYBR verde, Cristal Violeta Metil e Azul. Destes,Metil Blue e Cristal Violeta não requerem a exposição do gel à luz UV para a visualização das bandas de DNA, reduzindo assim a probabilidade de mutação se a recuperação do fragmento de ADN a partir do gel é desejada. No entanto, as suas sensibilidades são mais baixos do que a de EtBr. SYBR ouro e SYBR verdes são ambos altamente sensíveis, uv corantes dependentes, com menor toxicidade do que EtBr, mas são consideravelmente mais caros. Além disso, todos os corantes alternativos ou não pode ser ou não funcionam bem quando adicionado directamente ao gel, portanto, o gel terá de ser coradas pós após a electroforese. Devido à facilidade de custo, de uso, e sensibilidade, EtBr continua a ser o corante de escolha para muitos investigadores. No entanto, em determinadas situações, tais como quando a eliminação de resíduos perigosos é difícil ou quando jovens são realizar um experimento, um corante menos tóxica pode ser preferido. Corantes de carregamento utilizadas no eletroforese em gel de servir a três propósitos principais. Primeiro adicionam densidade para a amostra, Permitindo que a afundar-se no gel. Em segundo lugar, os corantes proporcionar cor e simplificar o processo de carregamento. Finalmente, os corantes mover na taxa padrão através do gel, o que permite para a estimativa da distância que os fragmentos de DNA ter migrado. As dimensões exactas dos fragmentos de DNA separados pode ser determinada através da representação gráfica do logaritmo do peso molecular das bandas diferentes de um padrão de DNA contra a distância percorrida por cada banda. O padrão de DNA contém uma mistura de fragmentos de ADN de tamanhos pré-determinados que podem ser comparados contra as amostras de DNA desconhecidos. É importante notar que as diferentes formas de ADN mover-se através do gel com taxas diferentes. DNA de plasmídeo superenrolado, devido à sua conformação compacta, se move através da rápida em gel, seguida por um fragmento de DNA linear do mesmo tamanho, com a forma circular aberta viajando o mais lento. Em conclusão, uma vez que a adopção de géis de agarose na década de 1970 para a separação de DNA, que temprovado ser uma das técnicas mais úteis e versáteis na investigação ciências biológicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Eu Agarose </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> O brometo de etídio </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Cancerígeno-precisa ser eliminados como resíduos perigosos </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Pescador </td><td> BP2401-212 </td><td> Corrosivo </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tronco e ramose cianol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigador / FX sistema de documentação de gel </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coruja Easycast B1 mini-sistema de eletroforese em gel </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS fonte de alimentação 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

De agarose de electroforese em gel é a forma mais eficaz de separar fragmentos de ADN de tamanhos variados que variam de 100 pb a 25 kb 1. De agarose é isolado a partir da alga géneros Gelidium e Gracilaria, e consiste de agarobiose repetido (L-e D-galactose) subunidades 2. Durante a gelificação, os polímeros de agarose associar não covalentemente e formam uma rede de feixes cujos poros tamanhos determinar um gel moleculares propriedades de peneiração. A utilização de electroforese em gel de agarose revolucionou a separação de DNA. Antes da adopção de géis de agarose, o DNA foi primeiramente separados utilizando sacarose centrifugação em gradiente de densidade, que apresentou apenas uma aproximação de tamanho. Para separar o DNA usando electroforese em gel de agarose, o DNA é carregado no pré-moldados poços no gel e uma corrente aplicada. A espinha dorsal do fosfato do ADN (e RNA) molécula é carregada negativamente, por conseguinte, quando colocado num campo eléctrico, fragmentos de ADN irá migrar para a positively carregada ânodo. Como o DNA tem uma relação de massa / carga uniforme, moléculas de DNA são separados por tamanho dentro de um gel de agarose num padrão tal que a distância percorrida é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular 3. O modelo principal para o movimento de DNA através de um gel de agarose é &quot;enviesada reptation&quot;, em que o bordo de ataque se move para a frente e puxa o resto da molécula ao longo de 4. A taxa de migração de uma molécula de DNA através de um gel é determinada pela sequência: tamanho 1) da molécula de ADN, 2) concentração de agarose, 3) conformação de DNA 5, 4) presença de tensão aplicada, 5) de brometo de etídio, 6) tipo de agarose e 7) tampão de electroforese. Após a separação, as moléculas de ADN podem ser visualizados sob luz UV, após coloração com um corante apropriado. Seguindo este protocolo, os alunos deverão ser capazes de: <ol><li> Compreender o mecanismo pelo qual os fragmentos de DNA são separados dentro de uma matriz de gel </li><li> Entenda como conformação daMolécula de ADN irá determinar a sua mobilidade por meio de uma matriz de gel </li><li> Identificar uma solução de agarose de concentração adequada para suas necessidades </li><li> Preparar um gel de agarose para eletroforese de amostras de DNA </li><li> Configure o aparelho de eletroforese em gel e fonte de alimentação </li><li> Seleccionar uma tensão apropriada para a separação de fragmentos de ADN </li><li> Compreender o mecanismo pelo qual o brometo de etídio permite a visualização das bandas de DNA </li><li> Determinar os tamanhos dos fragmentos de DNA separados </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

763.5K visualizações.  University of California Los Angeles. Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Vídeo: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

Rastreamento em tempo real da separação de fragmentos de DNA por smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Bioquímica

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Bioengenharia

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
The video explains the mechanism by which DNA fragments are resolved on an agarose gel, and it provides a step-by-step generalized procedure for how to prepare agarose gels, load DNA samples, run a DNA gel, visualize DNA fragments, and properly dispose of the gel and running buffer after the experiment is concluded.

DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

Eletroforese em gel de DNA

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

Education

JoVE Science Education

Biologia Básica

Métodos Básicos em Biologia Celular e Molecular

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

Separação de Proteína com SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.
This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

Gel Purification: Recovery of DNA Fragments after Electrophoretic Separation

Purificação de Gel

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

Microfluidic Capillary Electrophoresis for Fragment Sizing of PCR Products: A Microchip-Based Electrophoretic Separation Technique to Separate DNA Fragments Based on Size

Source: Wang, H., Zhu et al. <a href="https://www.jove.com/v/59963">A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the microfluidic capillary electrophoresis technique to separate PCR amplicons based on their size. This technique helps in fragment sizing using fluorescent dyes and standard molecular size markers.

Eletroforese capilar microfluídica para dimensionamento de fragmentos de produtos de PCR: uma técnica de separação eletroforética baseada em microchip para separar fragmentos de DNA com base no tamanho

Source: Wang, H., Zhu et al. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

Técnicas de Eletroforese

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

Eletroforese em Gel de Agarose de DNA

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

JoVE Core

Biologia Molecular

Unidade 2

Estudando DNA e RNA

TERMOS E CONCEITOS CHAVE

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

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Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Prepare two separating gels as described in the text manuscript. Pour the gel between the glass plates using a 1-milliliter pipette, ensuring that the upper 2 centimeters are free of the mixture. Add 70% ethanol on top of the separating gel, creating an even interface between the two layers.
Once the separating gels have polymerized, prepare the stacking gels using instructions in the text manuscript. Then, remove the ethanol from the separating gels, and add the stacking gel solution. Carefully insert a comb with the desired number of pockets, without introducing air bubbles, and allow the gel to polymerize for 20 to 30 minutes.
Load 4 microliters of each sample, as well as the protein ladder, into separate wells. Then, run the gel in Tris-Glycine running buffer at 144 volts for 45 minutes at room temperature. Use pre-warmed Fairbanks solution A to stain the gels on a rocker for 30 minutes, and pre-warmed Fairbanks solution D to decolor the gels on a rocker until the desired background is achieved.

Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio para análise de proteínas: uma técnica para separar e visualizar proteínas com base no peso molecular