Todo o trabalho foi realizado no Centro de Duque de Microscopia Na Vivo, uma NIH / NIBIB nacional Biomédica Technology Resource Center (P41 EB015897) e NCI Pequenos Animais do Programa de Recursos Imaging (U24 CA092656). Apoio adicional foi fornecido a partir de NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).

1. Montar e calibrar sistema de ultra- <ol><li> O sistema de ultra-som começa com um transdutor de ultra-som de um único elemento com um diâmetro de largura suficiente para cobrir o cérebro do rato e uma frequência central na gama de 2 MHz. O transdutor é accionado por um amplificador de potência 50-dB, que está ligado a um gerador de sinal que produz a sequência de impulsos de ultra-som. </li><li> Para calibrar a pressão acústica do sistema de ultra-som, usar um hidrofone para relacionar a tensão aplicada à pressão acústica resultante. Coloque o transdutor num tanque de água sobre o hidrofone. Aplicar um pulso simples (por exemplo, uma sinusóide 10-ciclo à frequência do transdutor com o pulso de frequência de repetição de 10 Hz), para o transdutor. Usar uma etapa de tradução 3-eixo para encontrar o pico de resposta, que deve ser colocado no centro do feixe de ultra-som no foco natural do transdutor (aproximadamente 60 mm para o nosso milímetros de diâmetro do transdutor 13 MHz 2,15). </li><li> Faça várias medições ao longo de um tocoue de tensões de entrada (por exemplo, 50-400 mV pp) para verificar a linearidade do sistema. Usar uma regressão linear simples para estimar a relação entre a tensão de entrada e de pressão acústica. No nosso sistema, tensões de entrada de 258 e 167 mV pp correspondeu a-pico negativas pressões acústicas de 0,52 e 0,36 MPa. </li><li> Programar o gerador de sinais para produzir uma sequência de impulsos de ultra-som que consiste em rajadas de pulsos sinusoidais na frequência transdutor com 50000 ciclos por rebentamento e um período de explosão de 64 ms. Com base nas medições de calibração, definir a amplitude de impulsos para gerar pressões de pico-negativas acústicas de 0,36 MPa no centro do foco natural do transdutor. </li></ol> 2. Preparar os Reagentes <ol><li> Dissolve-se cloreto de manganês tetra-hidratado (MnCl 2 · 4H 2 O) em água estéril a uma concentração de 100 mM (300 mOsm) e filtro esterilizar. </li><li> Produzir a lipídico perflutreno microesferas por &quot;activating «o frasco na agitador fornecido pelo fabricante durante 45 s. Para um dia de experiências, um único frasco pode ser activada uma vez no início do dia e utilizado sem reactivação para o resto do dia. </li><li> Imediatamente antes da administração de microesferas, agitar o frasco com a mão durante 1 min para ressuspender as microsferas. Ao retirar as microbolhas do frasco, não injectar ar ambiente para dentro do frasco, como este degrada as microbolhas restantes. Deixe o frasco até que o último uso do dia, e depois armazená-lo em uma geladeira. Mantido dessa forma, um único frasco pode durar vários dias. Re-activar o frasco armazenado no agitador, antes da primeira utilização em dias subsequentes. </li></ol> 3. Preparação dos animais <ol><li> Anestesiar os animais com isoflurano, entregue pelo cone do nariz. O aparelho de cone de nariz devem ser concebidos para fixar a cabeça do animal com precisão e fiabilidade na mesma posição de cada vez. Nosso dispositivo 15 mantém a cabeça em diae &quot;crânio-plana&quot; posição (isto é, a superfície do crânio dorsal é horizontal) utilizado no cérebro Paxinos atlas 16. Titular o anestésico para manter uma freqüência respiratória entre 85 e 125 respirações por minuto. Manter a temperatura do corpo utilizando uma lâmpada de aquecimento ou ar soprado. Proteger os olhos com lubrificante. </li><li> Remova o cabelo do couro cabeludo do mouse usando um aparador elétrico. </li><li> Coloque um catéter na veia da cauda e um cateter intraperitoneal (IP). Para estudos de sobrevida, não se esqueça de usar a técnica estéril apropriado; cateter IP demonstrado no vídeo para este artigo é apropriado apenas para não-sobrevivência experimentos. </li><li> Faça as preparações adicionais necessários para o experimento de estimulação neuronal. Para o mapeamento de estimulação vibrissas do córtex campo barril, usar um microscópio de dissecação e tesoura microcirúrgicos para cortar o vibrissas tão perto quanto possível da superfície da pele sem folículo do irritante ou pele circundante. </li><li> Coloque o gel de ultra-som nacouro cabeludo e, em seguida inferior da coluna de água contida por uma folha de plástico fino (por exemplo, um 7,6 uM forro lixeira) para a cabeça. Alcançar através de coluna de água com um cotonete de ponta para empurrar as bolhas de ar que ficam presas no gel de ultra-som. Posicione o transdutor de ultra-som na sua distância focal natural (58 mm) diretamente sobre o cérebro do rato na coluna de água, e limpe o transdutor com uma ponta do dedo para eliminar as bolhas de ar retidas. </li></ol> 4. Hematoencefálica Barreira Abertura com Microbolhas e ultra-som (BOMUS) <ol><li> Dar uma injecção intraperitoneal da solução de manganês a uma dose de 0,5 IP mmol / kg. Tapar o cateter intraperitoneal de modo que o manganês não flui para fora, e esperar 10 minutos para permitir que a distribuir (Figura 1). </li><li> Para abrir o BBB, administrar 30 uL de lípido perflutreno microesferas (DEFINITY activado) através do cateter da veia da cauda, ​​e simultaneamente, inicia a sequência de impulsos de ultra-som. Continuar insonification durante 3 minutos. </li></ol> 5. Estimulação Neuronal <ol><li> Permitir que cerca de 40 minutos para os níveis cerebrais de Mn 2 + para estabilizar antes de iniciar a estimulação neuronal. Desta forma, o acessório de linha de base dramática devido à Mn 2 + difusão através da BHE pode ser distinguido do reforço diferencial subtil devido à estimulação. Em seguida, começam a estimulação com o seu paradigma de escolha (Figura 1). </li><li> Para a estimulação das vibrissas, desligue o isoflurano e remover o cone do nariz. Mover pincel um artista mole manualmente com um movimento circular (1-5 Hz) através da matriz vibrissas a uma distância de aproximadamente 2-5 mm a partir da pele. Continuar a estimulação durante 90 min. O manganês tem um efeito sedativo que permite a estimulação descontrolada do animal. Se o animal torna-se agitado, administrar 5% de isoflurano através cone de nariz durante aproximadamente 15 segundos. </li></ol> 6. Magnetic Ressonância <ol><li> Após a estimulação, retomar a anestesia através de cone do nariz. Continuar a manutenção da temperatura do corpo e titulando o nível isoflurano a uma taxa respiratória de 85-125 respirações por minuto. </li><li> Posicione o mouse em uma bobina de ressonância magnética e transferir para o aparelho de ressonância. Adquira 3D de alta resolução T 1 ponderados imagens de RM. Por exemplo, usar um gradiente 3D estragado recordar eco sequência (SPGR) com os seguintes parâmetros: tempo de repetição de 25 ms; tempo de eco de 2 ms; flip ângulo de 30 graus; largura de banda de 15,63 kHz; campo de visão de 20 × 20 × 12 mm; matriz de 128 × 128 × 60. </li></ol> 7. Análise de Imagem <ol><li> A análise de imagem é específico para o paradigma de estimulação utilizada. Para a experiência de estimulação vibrissas (Figura 2), importar as imagens a partir de vários animais em um ambiente de análise apropriado. Se alguns animais foram estimuladas, à direita, enquanto os outros foram estimulados no lado esquerdo, flip algum modo que todas as imagens são efetivamente &quot;deixou-estimulado.&quot; Em seguida, para comparar o lado estimulado de cada cérebro para o seu lado contralateral não estimulada, criar um duplicado e espelhado deixou-não estimulada conjunto de imagem é criada. Registre todas as imagens para um espaço comum e, em seguida, alisá-los com um × 3 × 3 3 pixels kernel Gaussiano. </li><li> Exportar os dados para um ambiente de análise matemática, tais como MATLAB. Opcionalmente, mascarar anatomia irrelevante para os conjuntos de dados. Intensidade de normalizar as imagens pelo método iterativo de Venot et al. 17,18. </li><li> Usar uma emparelhadas, teste t de cauda única para comparar cada voxel dos lados estimulados de cada cérebro para o voxel correspondente contralateral nos lados não estimuladas de cada cérebro. </li><li> Exibir o mapa valor de p resultante para identificar regiões de actividade diferencial (Figura 3). </li></ol> 8. Os resultados representativos O método aqui apresentado tem dois fundos<html> amental etapas: (1) Abertura BBB com Microbolhas e ultra-som (BOMUS) e (2) induzida por ativação Manganês-RM (AIM MRI). Porque o último passo depende do anterior, é importante verificar BOMUS implementação bem sucedida. Perturbações da barreira sangue-cérebro após a administração de um T 1-encurtamento agente de contraste (tais como manganês ou um agente de gadolínio-based) resulta num aumento do sinal no parênquima cerebral em T 1-ponderada de imagem quando em comparação com cérebros em que BOMUS não foi executada (Figura 4). A distribuição de este acessório de manganês não é completamente uniforme, embora seja razoavelmente consistente entre animais. A distribuição não reflecte inomogeneidade apenas na abertura BBB, mas também é a distribuição não-uniforme intrínseca de Mn no interior do cérebro 19. A dinâmica espacial e temporal da abertura BBB ter sido ainda descrito anteriormente 12. ent &quot;&gt; Uma vez BOMUS foi implementado com sucesso, o próximo passo é a realização de ressonância magnética AIM Muitos paradigmas experimentais é possível,.. no entanto, porque há muitos potenciais confunde, os controles e análises devem ser cuidadosamente concebidos efeitos de confusão incluem abertura BBB heterogênea, acumulação não homogénea de Mn no cérebro, dinâmica temporal de difusão Mn, e actividade neuronal inespecífica. Nesta demonstração, a resposta à estimulação neuronal unilateral do vibrissas foi mapeado. Para compensar as não homogeneidades e fluxo de Mn, o lado não estimulado de cada cérebro foi utilizado como um controlo interno. Para ter em conta para a actividade neuronal inespecífica que pode variar entre os animais, a análise estatística de teste utilizado para identificar regiões que foram consistentemente diferente entre os animais (Figura 2). Os resultados foram um mapa diferença tridimensional e um tridimensional valor de p-mapa (Figura 3), do lado direito do que indicou regiõesde maior sinal contralateral à vibrissas estimulada. O lado esquerdo do mapa indicam quais as regiões tinha sinal significativamente mais elevado ipsilateral à vibrissas estimulada. O mapa de valor de p identificou uma região larga de sinal elevada contralateral à vibrissas estimulado que correspondia ao campo barril do córtex sensorial primário, cuja resposta a estimulação vibrissas tem sido extensivamente documentado por electrofisiologia 20,21 e 2-desoxiglucose estudos. Uma discussão mais completa destes resultados foi publicada previamente 13. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig1.jpg" /> Figura 1. Protocolo cronograma de neuroimagem funcional com BOMUS e RM AIM (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig2.jpg" /> Figura esquema da Análise 2. Para a identificação de regiões of intensidade diferente entre os lados estimuladas e não estimuladas de cada cérebro. Para comparar o lado estimulado de cada cérebro para o seu lado contralateral não estimulada, um duplicado e espelhado deixou-não estimulada conjunto de imagem é criada. Estas imagens são registadas, filtrada, e normalizada. Finalmente, no teste compara as imagens esquerda e deixou-estimuladas-não estimulada. O teste t é &quot;emparelhado&quot; de modo que o lado estimulado de cada cérebro é apenas comparado com o lado não estimulado do mesmo cérebro. O teste t é &quot;de cauda única&quot; de modo que um lado do mapa valor de p indica que o sinal significativamente mais elevado do lado estimulado do cérebro, enquanto o outro lado do mapa valor de p indica que o sinal significativamente mais elevado do lado não estimulado do cérebro (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig3.jpg" /> Figura 3. Os resultados da análise combinada de 7 animais menos dois diferentes posições axiais. T<html> ele primeira coluna mostra a média de todas as imagens registradas alinhados, de modo que efetivamente todos os ratos tiveram sua vibrissas esquerdo estimulado. Estas imagens são sobrepostas com um mapa de cor, indicando o aumento percentual média na sinal em cada voxel relativa ao hemisfério contralateral, como indicado pela barra de cores. Regiões coloridas sobre o lado direito da imagem mostram onde o hemisfério contralateral à estimulação tiveram maior do sinal. Regiões colorido no lado esquerdo da imagem mostram onde o hemisfério ipsilateral à estimulação tiveram maior do sinal. A segunda coluna mostra as mesmas imagens sobrepostas com o mapa de valor de p indicando a significância estatística do aumento do sinal. A terceira coluna apresenta o mapa valor de p mesmo sobreposto sobre as figuras correspondentes a partir da estereotáxico Paxinos atlas 16 com os campos de barril do córtex sensorial sombreada (adaptado de Howles et al. 13). / 4055/4055fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Distribuição espacial de Mn 2 + no cérebro. As imagens foram adquiridas 170 min após a 0,5 mmol / kg IP de MnCl2 a partir de BOMUS-tratados (n = 5) e de controlo (n = 4) ratinhos. Após a normalização, média e mapas de desvio-padrão foram calculados (painel à esquerda). Enhancement foi maior nos ratos tratados com BOMUS. Embora este acessório não era uniforme em toda a cérebro, era razoavelmente consistente, excepto perto das bordas do cérebro e os ventrículos. Usando regiões de interesse (ROIs) desenhadas em torno de várias estruturas, o SNR média (+ 1 DP) foi calculado em cada grupo (painel direito). BOMUS animais tratados apresentaram maior SNR, mas também uma maior variância entre as estruturas e entre animais (Adaptado de Howles et al. 13). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig5.jpg" /> Figura 5. Para examinar os efeitos de tecido de BOMUS, os cérebros de ratinhos tratados com BOMUS foram fixadas, SEctioned a 500 - intervalos mM, e corados com hematoxilina e eosina. O número médio de extravasamento de glóbulos vermelhos vistas em cada secção do cérebro é mostrado para pressões acústicas de 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), e 5,0 MPa (n = 1). As barras de erro mostram o erro padrão. O segundo painel mostra um exemplo de extravasamento de células vermelhas do sangue grave a partir do cérebro exposto a 5,0 MPa (adaptado de Howles et al. 12). <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig6.jpg" /> Figura 6. Teste comportamental quantitativa foi utilizado para avaliar a actividade, excitação, e capacidade de resposta antes da anestesia, e 3 e 24 horas após a recuperação da anestesia. O sistema de pontuação, descrito anteriormente 12, foi baseada na bem estabelecida avaliação quantitativa do mouse comportamental desenvolvered por Irwin em 1968 22. O comportamento da média (± SEM) pontuação para o controlo (n = 3) e BOMUS (0,36 MPa) tratados (n = 8) Os animais é mostrado. Relativa à linha de base pré-anestesia, todos os animais mostram uma diminuição na pontuação comportamento de 3 horas após a anestesia, mas eles largamente recuperar até ao dia seguinte. Em cada ponto do tempo, não foi observada diferença entre os dois grupos, indicando que BOMUS não mensurável afetam o comportamento animal (Adaptado de Howles et al. 12).

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S., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese:+Recent+advances+in+understanding+its+transport+and+neurotoxicity.">Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).</li><li>Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-enhanced+MRI+of+the+mouse+auditory+pathway.">Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway.</a> Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).</li><li>Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+auditory+brain+mapping+in+mice+with+Mn-enhanced+MRI.">In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI.</a> Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+mapping+of+sound-evoked+activity+in+the+mouse+auditory+midbrain+using+Mn-enhanced+MRI.">Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI.</a> Neuroimage. 39, 223-230 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, um método foi apresentado de forma não invasiva para a abertura do BBB por todo o cérebro de camundongo inteiro com ultra-som e microbolhas (BOMUS). Com a abertura BBB, Mn 2 + foi administrada e induzida por activação de manganês-RM (AIM MRI) foi usado para resposta de imagem neuronal a curta duração estimulação em ratinhos sedados. Abertura BBB adequada foi obtida com uma pressão de pico negativo acústico de 0,36 MPa. Observação, esta é a pressão na superfí...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Hidrofone </td><td> Sonora Medical Systems, Longmont, CA </td><td> SN S4-251 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio de tradução </td><td> Newport Corporation, Irvine, CA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Transdutor de ultra-som </td><td> Olympus NDT, Inc., Waltham MA </td><td> A306S-SU </td><td> Analise folha do fabricante de teste que acompanha o transdutor para encontrar a frequência central exacta do que transdutor particular, que pode ser diferente da frequência nominal listado no catálogo. (Por exemplo, a frequência nominal de nosso transdutor foi de 2,25 MHz, mas a frequência central real foi de 2,15 MHz.) </td></tr><tr><td> Vevo Imagem da Estação </td><td> VisualSonics, Inc. Toronto, Canadá </td><td>; </td><td></td></tr><tr><td> 50 dB amplificador de potência </td><td> E &amp; I, Rochester, NY </td><td> modelo 240L </td><td></td></tr><tr><td> Gerador de sinal </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> modelo 33220A </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 - (H2O) 4 </td><td> Sigma </td><td></td><td> Peso molecular varia de acordo com lote, contato com o fabricante para a medição exata </td></tr><tr><td> Lipídico perflutreno microesferas </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> DEFINITY </td><td></td></tr><tr><td> Agitador microesfera </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> Vialmix </td><td></td></tr><tr><td> MR bobina de imagem </td><td> m2m Imaging Corp, Hillcrest, OH </td><td></td><td> 35 mm de diâmetro em quadratura de transmissão / recepção bobina de volume </td></tr><tr><td> Sistema de ressonância magnética </td><td> GE Healthcare, Milwaukee, WI </td><td></td><td> GE consola EXCITE operar um 7-T ímã furo horizontal </td></tr><tr><td> Ambiente de análise de imagem </td><td> Imagem Visage, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA </td><td> Amira MATLAB </td><td></td></tr></tbody></table>

functional neuroimaging using ultrasonic blood-brain barrier disruption and manganese-enhanced mri

Apesar de os ratos são o sistema modelo dominante para estudar as bases genéticas e moleculares da neurociência, neuroimagem funcional em ratos permanece tecnicamente desafiador. Uma abordagem, induzida por activação de manganês-RM (AIM MRI), tem sido utilizado com sucesso para mapear a actividade neuronal em roedores 1-5. Em AIM RM, Mn 2 + actua um análogo de cálcio e se acumula nos neurónios despolarizadas 6,7. Porque Mn 2 + reduz a propriedade tecido T 1, as regiões de atividade neuronal elevada irá aumentar em ressonância magnética. Além disso, Mn 2 + limpa lentamente a partir das regiões activados e, portanto, a estimulação pode ser realizada fora do magneto antes da imagem, permitindo uma maior flexibilidade experimental. No entanto, porque Mn 2 + não atravessam facilmente a barreira sangue-cérebro (BBB), a necessidade de abrir o BBB tem limitado o uso de AIM RM, especialmente em ratinhos. Uma ferramenta para a abertura do BBB é ultrasound. Embora potencialmente prejudiciais, se ultra-som é administrado em combinação com microbolhas cheias de gás (ie, os agentes de contraste de ultra-som), a pressão acústica necessária para a abertura BBB é consideravelmente menor. Esta combinação de ultra-som e microbolhas pode ser usado para fiavelmente abrir o BBB sem causar danos aos tecidos 8-11. Aqui, um método é apresentado para a realização de AIM MRI usando microbolhas e ultra-som para abrir o BBB. Depois de uma injecção intravenosa de microbolhas perflutreno, um feixe de ultra-som desfocado pulsado é aplicada à cabeça de rato raspada durante 3 minutos. Por simplicidade, nos referimos a esta técnica de Abertura BBB com Microbolhas e ultra-som como BOMUS 12. Usando BOMUS para abrir o BBB longo de ambos os hemisférios cerebrais, manganês é administrado ao cérebro de rato inteiro. Após a estimulação experimental dos ratos levemente sedados, AIM MRI é usado para mapear a resposta neuronal. Parademonstrar essa abordagem, aqui BOMUS e AIM ressonância magnética são utilizados para mapear a estimulação mecânica unilateral das vibrissas em camundongos levemente sedados 13. Devido BOMUS pode abrir o BBB longo de ambos os hemisférios, o lado não estimulado do cérebro é usado para controlar para a estimulação de fundo não específico. O mapa de ativação resultante 3D concorda bem com representações publicados das regiões vibrissas do campo barril córtex 14. A abertura ultra-sônica do BBB é rápido, não invasivo e reversível; e, portanto, esta abordagem é adequada para estudos de alto rendimento e / ou longitudinal em ratos acordados.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Uma técnica é descrita para amplamente abertura da barreira sangue-cérebro no ratinho usando microbolhas e ultra-som. Usando esta técnica, o manganês pode ser administrada para o cérebro do rato. Porque o manganês é um agente de contraste para IRM que se acumula nos neurónios despolarizadas, esta abordagem permite imagiologia de actividade neuronal.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

functional-neuroimaging-using-ultrasonic-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K visualizações.  Stanford University. Uma técnica é descrita para amplamente abertura da barreira sangue-cérebro no ratinho usando microbolhas e ultra-som. Usando esta técnica, o manganês pode ser administrada para o cérebro do rato. Porque o manganês é um agente de contraste para IRM que se acumula nos neurónios despolarizadas, esta abordagem permite imagiologia de actividade neuronal.

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Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Medir o valor subjetivo de Opções de risco e ambígua usando Economia Experimental e funcional métodos de ressonância magnética

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Neurociência

Optogenetic Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Ressonância magnética funcional optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in remote locations. This paper shows the development of field functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) imaging to the study of child language, reading, and cognitive development in a rural village setting of C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and the development of culturally appropriate neuroimaging protocols allow&#160;a first-time look into the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in understudied environments. This paper demonstrates protocols for transporting and setting up a mobile laboratory, discusses considerations for field versus laboratory neuroimaging, and presents a guide for developing neuroimaging consent procedures and building meaningful long-term collaborations with local government and science partners. Portable neuroimaging methods can be used to study complex child development contexts, including the impact of significant poverty and adversity on brain development. The protocol presented here has been developed for use in C&#244;te d&#39;Ivoire, the world&#39;s primary source of cocoa, and where reports of child labor in the cocoa sector are common. Yet, little is known about the impact of child labor on brain development and learning. Field neuroimaging methods have the potential to yield new insights into such urgent issues, and the development of children globally.

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy NIRS Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches (functional Near Infrared Spectroscopy) provide advances to the study of the brain in previously inaccessible regions; here, rural C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and development of culturally-appropriate neuroimaging protocols permits novel study of the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in environments with significant poverty and adversity.

Métodos de neuro-imagem campo usando funcional perto de neuroimagem de espectroscopia de infravermelho (NIR) para estudar o Desenvolvimento Global da criança: Rural África subsahariana

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Role of Diffusion MRI Tractography in Endoscopic Endonasal Skull Base Surgery

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of benign and malignant lesions through a natural anatomical extra-cranial pathway, represented by the nasal cavities, avoiding brain retraction and neurovascular manipulation. This is reflected by the patients' prompt clinical recovery and the low risk of permanent neurological sequelae, representing the main caveat of conventional skull base surgery. This surgery must be tailored to each specific case, considering its features and relationship with surrounding neural structures, mostly based on preoperative neuroimaging. Advanced MRI techniques, such as tractography, have been rarely adopted in skull base surgery due to technical issues: lengthy and complicated processes to generate reliable reconstructions for inclusion in the neuronavigation system. 
This paper aims to present the protocol implemented in the institution and highlights the synergistic collaboration and teamwork between neurosurgeons and the neuroimaging team (neurologists, neuroradiologists, neuropsychologists, physicists, and bioengineers) with the final goal of selecting the optimal treatment for each patient, improving the surgical results and pursuing the advancement of personalized medicine in this field.

We present a protocol to integrate diffusion MRI tractography in patient work-up to endoscopic endonasal surgery for a skull base tumor. The methods for adopting these neuroimaging studies in the pre- and intra-operative phases are described.

Papel da Ramografia de Ressonância Magnética em Cirurgia de Base do Crânio Endonasal Endoscópica

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of ...

Medição da resistência transendotelial para avaliar a integridade da barreira celular

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor em destaque: Aplicações da detecção TEER para avaliar a integridade da barreira celular 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...