Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58.268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance subvenção GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA concessão F31AI091484, Emory CFAR concessão P30 A1050409. Esta investigação foi realizada em uma instalação construída com o apoio de centros de pesquisa Melhoria Grant # C06 RR18386 do NIH / NCRR. As células de Jurkat, o conjunto de 20 péptidos Nef, bem como o de coelho anti-HIV-1 Nef soro foram obtidos a partir do NIH AIDS Research &amp; Programa Reagente de Referência, (Rockville, MD), de HIV-1.

I. Utilização de péptidos curtos, em análise biológica I.1. Mapeamento Motivos Biologicamente funcional utilizando Peptídeos <ol><li> Tratar as células com os péptidos de digitalização Nef <ol><li> Obter um conjunto de peptídeos de varredura da região de interesse. Para as nossas experiências, os péptidos 20-mer, com 10 sobreposição de aminoácidos, que abrangem toda a proteína HIV-1 Nef (205 aa) foram obtidas a partir do Programa Reagente de SIDA. Os péptidos são ensaiados individualmente, como se segue: </li><li> Adicionam-se 10 ng / ml de péptido no meio de cultura celular. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de cultura por placa de cultura de células Jurkat. </li><li> Incubar as culturas durante 24 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Terminal deoxynucleotidyltransferase mediada dUTP biotina Nick End Labeling (TUNEL) ensaio de apoptose <ol><li> Lavar as células com PBS 1X e fixar durante 30 min à temperatura ambiente com 4% de paraformaldeído em PBS 1X, pH 7,4. </li><li> Lava-se com PBS 1X, e permeabilizar com 0,1% de Triton X-100 por 10min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células duas vezes com 1X PBS. </li><li> Contagem de células coradas por epifluorescência num sistema de microscopia controlada por computador. </li></ol></li></ol> I.2. Análise da inibição competitiva usando Peptídeos <ol><li> Co-transfecção de peptídeos utilizando o Chariot Protein entrega kit de reagentes <ol><li> Por mistura de reacção a transfecção, dilua 1 ug de wtNef-GFP ADN plasmídico e 100 ng de ambos os péptidos de tipo selvagem derivadas do domínio SMR ou péptidos que contêm alanina, a substituição de aminoácidos individuais no motivo SMR, para um volume final de 100 ul com 1X PBS. </li><li> Dilui-se 6 ul de uma diluição de Reagente Carruagem de 1/10 até um volume final de 100 uL com água estéril, e combinar-se com a mistura de ADN-péptido diluído. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 30 min para permitir a formação da Carruagem / complexo DNA-péptido. </li><li> Pellets de 3 x 10 5 células Jurkat por centrifugação a 600 xg durante 5 min. </li><li> Lave as células duas vezes com 1X PBS, e ressuspender no complexo Carruagem / DNA-péptido. </li><li> Adicionar 400 ul de soro de meio RPMI 1640 para a suspensão e incubar as células em placas de cultura a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Adicionar 1 ml de meio RPMI 1640 fresco contendo 10% de FBS a cada placa e incubar as células durante 48 horas a 37 ° C. </li><li> Células colheita e determinar a eficiência de transfecção por microscopia de fluorescência. </li></ol></li><li> Nef-GFP secreção fluorescente ensaio leitor de placas de inibição peptídeo <ol><li> Recolher os meios condicionados isentos de células a partir de células colhidas e transferir 100 ul às cavidades individuais de uma placa de microtitulação de 96 poços preta. </li><li> Medida de fluorescência da GFP nos meios de comunicação em um GENEios fluorímetro Tecan com comprimento de onda de excitação de 485 nm e 515 nm de comprimento de onda de emissão em unidades fluorescentes relativos. </li><li> Defina o nível de fluorescência da GFP no controle (mídia a partir de células co-transfectadas com Nef-GFP e um peptídeo mexidos) A 100%. </li><li> Compare-se com o nível de fluorescência da GFP nos meios das células co-transfectadas com vários péptidos SMR para determinar as alterações na secreção de Nef-GFP. </li></ol></li></ol> I.3. Isolando Motivo Partners ligação usando Peptídeos como isca <ol><li> Co-imunoprecipitação com péptidos SMR <ol><li> Cultivar células de Jurkat em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS a 37 ° C num frasco de cultura de tecido T-75, e as células por centrifugação a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. Determinar a eficiência da transfecção, através da colocação da placa sob um microscópio de fluorescência, a captura de imagens, e subsequentemente contagem total de células e rotulado e determinar as células marcadas por cento. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS 1X, e transferi-la para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Microcentrífuga a 1.000 xg durante 1 min. Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lise α-FLAG por pipetagem suave. O tampão de lise: 50 mM Tris mistura • HCl pH 7,4, 150 mM de sódio chloride [NaCl], EDTA a 1 mM, e 1% de Triton X-100, com 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo [PMSF], e 10 ul / ml de cocktail de inibidores de protease para utilização com células de mamíferos e de extractos de tecido [PIC; Sigma]. Faça imediatamente antes de usar. </li><li> Diferencialmente microcentrífuga as suspensões a 2.000 xg durante 5 min, e a 13.000 xg durante 10 min para sedimentar os detritos celulares e o ADN, respectivamente. Recolhe-se o sobrenadante (daqui em diante referido como o &quot;ligado&quot;). </li><li> Adicionar 1 mg de proteína de lisado e 1 ng de qualquer péptido ou a SMRwt SMRmut a 20 ul de anti-FLAG M2 gel de afinidade (daqui em diante chamado de &quot;resina&quot;, Sigma). Note-se que tanto SMRwt e SMRmut usados ​​aqui têm uma sequência de marcador FLAG incorporados nos péptidos. Levar a mistura até um volume final de 1 ml em tampão de Co-IP (tampão de lise α-FLAG sem PMSF e PIC). Incubar a mistura a 4 ° C durante a noite, com rotação extremidade-a-extremidade. Como controlo negativo, incubar o lisado com a resina na ausência de qualquer péptido. </li><li> Pellet da resina por microcentrifugação a 5000 - 8000 xg durante 30 seg. Permitir resina que se contentar com 2 min antes de manusear a amostra e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Remover o sobrenadante com uma ponteira estreita-end, ou uma seringa Hamilton, tomando cuidado para não transferir qualquer resina. Ponteiras Narrow-end pode ser feita usando uma pinça de beliscar a abertura de uma pipeta de plástico até que seja parcialmente fechada. Lavar a resina com quatro vezes com 500 ul de tampão de lavagem (50 mM Tris • HCl pH 7,4, e NaCl 150 mM). Eluir as proteínas celulares ligados com 15 ug de péptido FLAG 3X (Sigma) em 50 ul de tampão de lavagem e incubar no balancim / agitador durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Concentra-se o eluato por precipitação com acetona, seguido por fervura em tampão de amostra de Laemmli (Bio-Rad). Separa-se as proteínas por SDS-PAGE a 4-20% em Tris-HCl Critério de gel pré-moldado (Bio-Rad). Coloração do gel com Azul Brilhante de Coomassie R-250 (Bio-Rad). Nota: para os experimentos de identificação de espectrometria de massa ( <strong&gt; Figura 4A), cada condição (Co-IP com SMRwt, SMRmut, ou sem péptido) foi realizada em quadruplicado, e os eluatos a partir de todas as quatro repetições foram combinadas antes da precipitação de acetona para um total de 4 mg de proteína total de entrada / condição). </li></ol></li><li> Co-imunoprecipitação com a proteína Nef-GFP <ol><li> Misturar 50 ml de Dynabeads proteína G esferas magnéticas (Invitrogen) com 2 ug de anticorpo monoclonal murino anti-GFP em 1 ml de 1X PBS com 0,02% de Tween 20 (PBS-T). Incubar a mistura com rotação extremidade-a-extremidade num tubo de Eppendorf de 1,5 ml durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Separa-se as esferas do buffer, colocando o tubo em 1,5 ml Magnasphere Tecnologia suporte de separação magnética (Promega Corp, Madison, WI), permitindo suspenso magnético, seguido por remoção do sobrenadante. Lave os anti-GFP esferas revestidas com 1 ml de PBS-T usando pipetagem suave. </li><li> Lise de células de Jurkat transf Nef-GFP com 1 ml de 1X tampão RIPA + por pipetagem suave e incubação durante 15 mem em gelo. + Tampão RIPA: 10X tampão de lise RIPA, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] 01:10 diluída em água estéril, 0,02% de azida de sódio [Sigma], e 0,1% de sulfato de dodecilo e sódio [SDS], com 1 mM de PMSF e 10 ul / ml PIC adicionado imediatamente antes de usar. </li><li> Pellet os restos celulares por microcentrifugação a 2000 xg durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante (daqui em diante referido como o &quot;ligado&quot;). </li><li> Adicionar 1 mg de proteína de lisado para os anti-GFP grânulos revestidos, trazer o volume final de 1 ml com 1X + tampão RIPA, e incubar-se a mistura com rotação extremidade-a-extremidade durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Para estudos de competição de péptidos, de 1 mg de proteína de lisado pode ser pré-incubadas com 2 ug de SMRwt SMRmut ou péptido em 1 ml de RIPA + 1X tampão, antes de serem adicionados aos anti-GFP grânulos revestidos. </li><li> Lavar os grânulos através de ressuspensão em 1 ml de tampão de lavagem (50 mM Tris • HCl pH 7,4, NaCl 150 mM e 0,1% de Tween 20). Incubar com rotação extremidade-a-extremidade durante 5 min a 4 ° C. Separa-se a grânulos de from a lavagem usando o suporte de separação magnética. Lavar as pérolas uma segunda e uma terceira vez com tampões de lavagem contendo NaCl 250 mM e 300 mM, respectivamente. </li><li> Voltar a suspender as pérolas em 200 ul de PBS, transferir a mistura para um tubo limpo, e separar as pérolas da lavagem sobre o suporte magnético. Ferver as esferas em 50 ul de tampão de amostra Laemmli, 5 min a 95 ° C, deixar a mistura a arrefecer durante 10 min à temperatura ambiente, e, em seguida, colocar a mistura sobre o suporte para a separação magnética, e recolhem-se os sobrenadantes (&quot;eluatos&quot;) . </li><li> Separa-se as proteínas do eluato por SDS-PAGE em um tampão Tris-HCl Critério pré-moldado em gel 8-16%. </li></ol></li><li> Espectrometria de massa <ol><li> Impostos as bandas de proteínas de interesse de géis corados com Coomassie. </li><li> Reduzir as amostras em 10 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT) durante 45 minutos a 37 ° C. </li><li> Alquilar as amostras em 55 mM de iodoacetamida durante 45 minutos a 25 ° C. </li><li> Digerir as amostras durante a noite com o seqüenciamento tentativa graupsin (Promega) a 37 ° C. </li><li> Dessalinizar os péptidos da amostra com ZipTip C-18 (Millipore). Misture os peptídeos da amostra com alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e identificá-los em um alvo MTP quadro III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA). </li><li> Realize conjunto dessorção / ionização tempo de laser matrix-assisted de vôo análise Espectrometria de Massa (MALDI-TOF/TOF), utilizando um Bruker Daltonics UltraFlex III TOF / TOF. </li><li> Compare os dados do MS / MS para os bancos de dados não-redundantes e Swiss-Prot NCBI usando o algoritmo Mascote ( <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ). </li></ol></li><li> Immunoblot Análise <ol><li> Separa-se as amostras de proteína por SDS-PAGE a 4-20% ou 8-16% de Tris-HCl Critério de géis pré-moldado (Bio-Rad). Transferir as bandas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose. </li><li> Lava-se a membrana em tampão salino Tris (TBS; Bio-Rad), durante 5 min. Bloco com 5% de leite desnatado em TTBS (TBS com 0,1% de Tween 20) durante 1 hora, agitando à temperatura ambiente. </li><li> Processo para a membrana de imunotransferência, utilizando um anticorpo específico primário em 5% de leite desnatado, com agitação a 4 ° C durante a noite. Lavar com TTBS, durante 20 min seguido por um conjugado de HRP de IgG de anticorpo secundário (H + L) em 5% de leite desnatado durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar em TTBS durante 30-60 min. </li><li> Detectar as bandas de proteínas por Western Blotting Reagente Luminol (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Exponha o filtro para filme fotográfico. Nota: Em algumas experiências, um reagente de extracção foi usada para retirar a membrana (Pierce, Rockford, IL), com hibridização subsequente com um anticorpo primário e secundário diferente. </li><li> Digitalizar os filmes de raios-X para o Adobe Photoshop 5.0.2. Realizar análise de densitometria utilizando o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). </li></ol></li></ol> II. Utilização de inibição de anticorpos em Análise Funcional II.1. A co-transfecção de anticorposs usando o Chariot Protein entrega kit de reagentes <ol><li> Por mistura de reacção a transfecção, diluir wtNef 1 ug de DNA do plasmídeo-GFP e 1 ug de qualquer anticorpo anti-mortalin ou anticorpo anti-tubulina-α, para um volume final de 100 ul com 1X PBS. Nota: Foi encontrado anteriormente que a co-transfecção do anticorpo anti-α-tubulina tem nenhum efeito detectável sobre a secreção exNef e, portanto, funciona como um eficaz controlo negativo nestas experiências. </li><li> Dilui-se 6 ml de Reagente Carruagem diluído para um volume final de 100 uL com água estéril, e combinar-se com a mistura de ADN-anticorpo diluído. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 30 min para permitir a formação da Carruagem / complexo DNA-anticorpo. </li><li> Pellets de 3 x 10 5 células Jurkat por centrifugação a 600 xg durante 5 min. </li><li> Lave as células duas vezes com 1X PBS, e ressuspender em Carruagem / complexo DNA-anticorpo. </li><li> Adicionar 400 ul de soro de meio RPMI 1640 para a suspensão e incubar a cvaras em placas de cultura a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Adicionar 1 ml de meio RPMI 1640 fresco contendo 10% de FBS a cada placa e incubar as células durante 48 horas a 37 ° C. </li></ol> II.2. Nef-GFP fluorescente Secreção Leitor de Placas de ensaio de inibição de anticorpos <ol><li> Recolher os meios condicionados isentos de células a partir de células colhidas e transferir 100 ul às cavidades individuais de uma placa de microtitulação de 96 poços preta. </li><li> Medida de fluorescência da GFP nos meios de comunicação em um GENEios fluorímetro Tecan com comprimento de onda de excitação de 485 nm e 515 nm de comprimento de onda de emissão em unidades fluorescentes relativos. </li><li> Definir o nível de fluorescência da GFP no controlo (meio de células co-transfectadas com a Nef-GFP e o anticorpo anti-tubulina-α) a 100%. </li><li> Compare-se com o nível de fluorescência da GFP nos meios das células co-transfectadas com o anticorpo anti-mortalin para determinar as alterações na secreção de Nef-GFP. </li></ol>

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	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A compreensão dos mecanismos subjacentes à capacidade da Nef manipular o caminho de tráfico exosomal será útil em inibidores da secreção exNef novos engenharia. A inibição da secreção exNef deve diminuir a depleção de células T CD4 e CIA que patogênese unidade HIV / AIDS. Para atingir este objetivo, temos desenvolvido uma série de novos reagentes e metodologias que nos permitiu analisar a genética da secreção exNef, e começar a determinar as proteínas celulares envolvidas. Esta abordagem também lev...

Com o advento da terapia anti-retroviral, a epidemia de aids no mundo ocidental tem sido abrandado, mas não reduzido, ea propagação do HIV continua a ser um importante problema de saúde em todo o mundo. Com a excepção do marginalmente eficaz RV144 Thai ensaio, vacinas anti-HIV até agora mostraram falta de protecção contra a infecção. Assim, a investigação sobre potenciais alvos terapêuticos adicionais, ainda se justifica. Junto com depleção de células T CD4, ativação imune generalizada persistente é uma característica da infecção pelo HIV. Esta ativação imune crônica (CIA) leva a um aumento no volume de células, subpopulações linfocitárias ativadas e diferenciadas, a exaustão celular e senescência, ea morte de células T e células B através da ativação morte celular induzida (AICD) 1,2,3, e está bem estabelecido como um dos mais fortes preditores de progressão da doença 4,5,6,7,8,9,10,11,12. No entanto, os mecanismos subjacentes a CIA e CD4Depleção na infecção por VIH de células T ainda de ser completamente elucidados. Evidência do nosso laboratório e outros levaram-nos a um modelo para a progressão da doença (Figura 1) em que a proteína Nef do HIV (factor regulador negativo) induz a sua secreção no exosomes de células infectadas pelo HIV-1 13,14. Estes exosomes Nef contendo (exNef) induzir a apoptose em diversas linhagens de células não infectadas incluindo células CD4 células T 15,16. Alternativamente, em monócitos / macrófagos exNef altera os padrões de expressão de genes, por exemplo, expressão de citoquinas e parece induzir um estado de activação imunitária marcação. Esse corpo de evidências sugere um papel importante para exNef na CIA e depleção de células T CD4. A compreensão dos mecanismos subjacentes à capacidade da Nef manipular o caminho de tráfico exosomal será útil em inibidores da secreção exNef novos engenharia. A inibição da secreção exNef deve diminuir a depleção de células T CD4e CIA que patogênese unidade HIV / AIDS. Para reunir as provas que levaram ao nosso modelo para o HIV / AIDS a progressão da doença e os dados posteriores que construíram sobre este modelo, desenvolvemos uma série de novos reagentes e metodologias que nos permitiu analisar a genética da secreção exNef, e começar a determinar a proteínas celulares envolvidas. No trabalho inicial, descobrimos que a proteína Nef, induz a apoptose em células espectadoras e é libertado extracelularmente a partir de células transfectadas com e Nef do HIV-infected 15. Os péptidos derivados a partir de (célula estromal Derived Factor de-1, alfa com splicing alternativo) SDF-1α tinha sido previamente demonstrado para reter a maior parte da actividade de ligação e sinalização da molécula de comprimento completo 17. Especulou-se que os peptídeos de Nef pode reter uma parte da actividade apoptótica da proteína total, e que estes péptidos seriam necessariamente conter o domínio apoptótica Nef (s). Para identificar esses peptídeos, e, conseqüentemente, a Nefdomínio apoptótica (s), obteve-se um conjunto de 20 HIV-1 Nef peptídeos digitalização a partir do NIH Research AIDS e do Programa de reagente de referência. Estes péptidos de 20-aa, cada sobrepondo 10 aminoácidos do seu vizinho, são denominados pelo número do último aminoácido, isto é, N20 vãos Nef aminoácidos 1-20, N30 vãos Nef aminoácidos 11-30, 16, etc. Descobrimos que a exposição de células T a péptidos específicos extracelularmente sobrepostos dois domínios de 10-aa distintos na proteína Nef de comprimento completo a apoptose induzida nessas células. Análise subsequente destes péptidos apoptóticos Nef derivados revelou a sua capacidade para interagir fisicamente com o receptor de quimiocina CXCR4 na superfície das células T, com a cinética de ligação que permitem estes péptidos para inibir competitivamente a ligação entre o CXCR4 e o seu ligando natural, SDF-1α. Finalmente, a interação dos peptídeos apoptóticos Nef derivados com CXCR4 foi encontrado para induzir uma resposta de estresse nestas células T-levando a apoptose. Esta prova permitiu quicdomínios funcionais da kly mapa Nef, um processo que teria levado muito mais tempo usando técnicas de mutagênicos DNA padrão, tais como alanina mutagênese de varredura. Também mostrou que estes péptidos curtos derivados de Nef mantida a função biológica dos domínios apoptóticas na proteína de comprimento completo. Tendo identificado um papel para Nef extracelular, ou seja, a apoptose das células T, procuramos uma melhor compreensão de como a Nef foi segregada a partir de células. Usando uma série de construções mutadas Nef, que mapeada altamente conservadas motivos de proteína Nef nas regiões N-terminais de ambas Nef do HIV, e sua equivalente Rhesus macaque mac SIV (vírus da imunodeficiência dos símios) Nef, que são críticos para a secreção exNef 13. Um destes motivos, a Região Modificação Secreção (SMR; 66VGFPV70), era particularmente crítico, como a substituição de alanina de qualquer dos seus cinco aminoácidos ou grandemente reduzida ou abolida secreção exNef. Quando entregue às células via C do Motif atividadeHariot Proteína Reagente de entrega, um peptídeo contendo o SMR ligado a uma sequência de péptido FLAG (SMRwt) foi encontrada para inibir a secreção de ambas exNef Nef transfectadas e células infectadas pelo HIV 18. Com base em nossa experiência anterior com peptídeos, decidimos usar esse peptídeo para elucidar as moléculas e os mecanismos subjacentes papel do Nef SMR na secreção exNef. Utilizando o nosso péptido SMRwt como &quot;proteína de isco&quot;, que co-imunoprecipitada parceiros de ligação celulares do SMR a partir de lisados ​​de células T-18 não infectadas. A sequência do péptido FLAG fornecida uma pega conveniente para capturar o péptido SMRwt usando resina de afinidade anti-FLAG. Nossa conclusão anterior de que um único valina para alanina mutação no peptídeo SMRwt foi suficiente para abolir a inibição da secreção de exNef identificado um peptídeo controle conveniente, altamente específico (SMRmut) que usamos para descartar proteínas co-imunoprecipitadas não específicos para a SMR. Utilização de um péptido com a sESPECÍFICAS domínio de interesse, em vez de a proteína de comprimento completo permitiu ultrapassar o rastreio de dezenas de factores celulares que se ligam a outros domínios Nef 19. Uma vez identificados os parceiros de ligação de SMR, o próximo passo lógico foi mostrar que os parceiros de ligação celulares identificados são importantes para a função biológica 18. O procedimento padrão para realizar isto é a níveis de proteína de knockdown utilizando miRNA proteína-alvo específico ou siRNA, e subsequentemente ensaio o efeito sobre a função biológica. Realizou knockdown miRNA, que inibe a tradução do ARNm alvo, reduzindo a produção desse objectivo, neste caso, uma proteína de ligação ao SMR. Esta redução da proteína alvo é um efeito indirecto, e, possivelmente, tem um efeito de atraso sobre a função biológica da proteína alvo tem um papel cm consequência, também empregaram a técnica menos comum de inibição de anticorpos para determinar se perturbar directamente a actividadea proteína alvo reduz ou elimina a função biológica. Neste processo, os anticorpos criados contra a proteína alvo são transfectados para a célula usando Reagente Carruagem, e interagir directamente com a proteína alvo, quer sequestrando-do seu local de função, ou o seu domínio de ligação de bloqueio pertinentes. A inibição da proteína-alvo através deste procedimento interrompe directamente a sua função, e pode complementar os procedimentos de knockdown de ARN, confirmando ainda a importância da proteína alvo para a função biológica. Enquanto Reagente Carruagem é eficaz no fornecimento de peptídeos e proteínas para as células, este processo é demorado e limita os tipos de experiências, por exemplo, a exposição repetida ou prolongada e em estudos em animais in vivo que podem ser executadas. Consequentemente, adicionou-se uma sequência de péptido de célula-penetrante (CPP) para o péptido SMRwt (SMRwt-CPP) 18 para gerar um péptido que pode ser absorvido pelas células passivamentea partir dos meios de cultura. Esta versão foi tão eficaz como o ex-exNef inibir a secreção. A evidência a partir destas experiências publicadas demonstra a capacidade de péptidos pequenos contendo motivos funcionais específicos para antagonizar a função da proteína de comprimento completo através da inibição competitiva, e para isolar as proteínas que se ligam a estes motivos. Seria de esperar que estas técnicas pode ser útil em vários protocolos experimentais. Eles também devem ser eficazes em novos inibidores de muitos processos celulares peptídeo engenharia; uma função que pode ser reforçada pela ligação a seqüências CPP.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

Péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento total, no nosso caso, o HIV-1 Nef, não só mantêm a sua função biológica, mas também pode inibir competitivamente a função da proteína de comprimento completo. Um conjunto de 20 péptidos Nef de varrimento, de 20 aminoácidos de comprimento, com cada uma sobreposição de 10 aminoácidos do seu vizinho, foram utilizados para identificar motivos de Nef responsável pela sua indução de apoptose. Os péptidos que contêm estes motivos apoptóticos apoptose induzida em níveis comparáveis ​​aos da proteína Nef de comprimento completo. Um segundo péptido, derivado da região Modificação Secreção (SMR) da Nef, reteve a capacidade de interagir com as proteínas celulares envolvidas na secreção de Nef no exosomes (exNef). Este péptido SMRwt foi usado como o &quot;isco&quot; proteína em experiências de co-imunoprecipitação de isolar as proteínas celulares que se ligam especificamente ao motivo do SMR Nef. A transfecção e o anticorpo de inibição da proteína foi utilizado para destruir fisicamente a aposta interacçãoween Nef e mortalin, uma das proteínas de ligação ao SMR isolado, e o efeito foi medido com um ensaio de secreção exNef baseado fluorescente. A capacidade do peptídeo de SMRwt para superá Nef completo para proteínas celulares que se ligam o motivo SMR, torná-lo o primeiro inibidor da secreção exNef. Assim, empregando as técnicas aqui descritas, que utilizam as propriedades únicas de péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento completo, pode-se acelerar a identificação de motivos funcionais em proteínas e ao desenvolvimento de inibidores à base de péptidos de funções patogénicos.

Mapeamento Motivos Biologicamente Funcionais utilizando péptidos. Duas regiões foram identificados nas proteínas Nef que induzem a apoptose. Apoptose Peptídeo orientado foi observada (Figura 2), começando com o péptido N50 (AA30-50), atingindo um máximo de N60 (AA40-60) e N70 (aa50-70), e para diminuir os níveis de base de péptido N100 (aa80-100). O principal motivo 1 (M1), pico, centrando-aa50-60, induz&gt; 80% dos níveis de apoptóticos da proteína Nef de comprimento comple...

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Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners | Immunology and Infection | Video

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

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12.3K visualizações.  Morehouse School of Medicine. Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...