Agradecemos Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner do Centro de Pesquisa Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG para apoio técnico e Julia Strobl pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi realizado como parte do projeto APPL2.0 e foi parcialmente financiado pela Província Autónoma de Bozen / Bolzano, Itália e Apple Consórcio Sul tirolesa.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Na tela de Y2H, a proteína efectora potencial é co-expressa com diferentes proteínas que interagem hipotéticas (passo 7). Cada clone de levedura crescendo contém a isca, mas um (potencialmente) interagente diferente. As proteínas que interagem são codificados numa biblioteca de ADNc que foi clonada em plasmídeos de presa. A isca ea presa plasmídeos cada código de co-cistronically para uma parte de um factor de transcrição de levedura. No caso de uma interacção física entre o isco (efector) e um interactor codificada pelo plasmídeo presa, as duas partes do factor de transcrição (o domínio de ligação de ADN e o domínio de activação) são unidos, e a expressão do gene repórter é induzida. A levedura é capaz de crescer em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. O tipo de biblioteca de ADNc de presa é dependente do efector rastreados e devem ser escolhidos em conformidade. O vector isco e presa, assim como a estirpe de levedura, devem ser compatíveis. Nesta tela, o domínio ea domai activação Gal4 de ligação a DNA LexAN foram utilizados como as unidades do factor de transcrição de levedura compatíveis. A biblioteca de cDNA podem ser construídos individualmente, feito à medida, ou obtidos comercialmente. A preparação da biblioteca presa cDNA não faz parte do presente protocolo. Neste protocolo, uma biblioteca de cDNA normalizada auto-construídas a partir do ARN das folhas domestica x Malus foi usada e clonado em pGAD-HA 41. O efector (isca) -expressing estirpe de levedura foi transformada com a biblioteca de presa, e os clones foram seleccionados em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. Para extrair ADN de plasmídeo a partir das colónias de levedura, um plasmídeo de DNA Mini Kit à base de coluna para as bactérias é recomendada em combinação com um passo de ruptura mecânica utilizando esférulas de vidro para melhorar a lise de levedura (passo 8). Neste purificação do plasmídeo, a isca e o vector presa serão purificados simultaneamente em concentrações relativamente baixas. No entanto, a quantidade de DNA de plasmídeo é suficiente para identificar o parceiro de interacção através de sequenciação witHout propagação plasmídeo antes (passo 8.4). Como alternativa, o ADN purificado no passo 8.4 pode ser transformado em competentes de E. coli e com a resistência aos antibióticos seleccionados mediada por vector de presa (por exemplo, ampicilina no caso de o pGAD-HA). A E. coli seleccionada colónias transportar apenas o plasmídeo biblioteca pGAD-HA, e a purificação do plasmídeo de alto rendimento podem ser realizadas com estes clones. A transformação bem-sucedida de construções pLexA-N e pGAD-HA complementa o triptofano e leucina auxotrofia de NMY51. Uma interacção entre o efector e uma proteína (codificada no pGAD-HA) conduz à activação do sistema repórter em estirpes NMY51. No caso de auto-activação, NMY51 transformada com o efector expressando pLexA-N em combinação com o vector de biblioteca vazio pGAD-HA cresce em placas selectivas falta Trp-Leu-His-ade, devido à activação indesejada do sistema repórter NMY51 40. A auto-ativação pode ser wEAK e pode ocorrer na ausência de Trp-Leu-His, ou a activação pode ser forte e caracteriza-se por crescimento em placas de Leu-Trp-His-ade 41. Auto-ativação pode causar um fundo maciço de clones falso-positivos na tela Y2H real. Para evitar isso, deve ser realizado um teste de auto-activação com a isca, em que o vector que expressa efectora é co-transformada com o vector vazio biblioteca. Nesta configuração experimental, a expressão do gene repórter não deve ser induzido. Se o auto-activação (isto é, crescimento em placas selectivas) é visível no teste, o meio pode ser suplementado com diferentes concentrações de 3-amino-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT é um inibidor da desidratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), uma enzima importante na biossíntese de histidina 46. A suplementação com 3-AT pode reduzir os efeitos fracos de auto-activação durante 47 Y2H telas,48. Diferentes concentrações de 3-AT deve ser testado. Neste protocolo, 1 - foram utilizados 40 mM 3-AT. A concentração mais baixa que leva à repressão da auto-ativação deve ser posteriormente utilizado na tela de Y2H. As placas selectivas do ensaio de auto-activação só pode ser avaliada, se as placas de SD-Trp-Leu do co-transformação contêm um número suficiente de clones. Como uma indicação ≥ 500 colónias por 90 mm (diâmetro) placa de Petri são suficientes. Para determinar a eficiência de transfecção exacta, recomenda-se para preparar diluições em série de levedura co-transformadas e espalhá-los em placas de SD-Trp-Leu. Para reduzir a auto-activação, o efector pode ser clonado pLexA-C, um vector de expressão de isca que funde a etiqueta de LexA para o C-terminal da proteína. A orientação do Lex-A tag pode atenuar auto-ativação 24. No entanto, isso não é possível em todos os casos para reduzir ou abolir a auto-activação. A formação decolónias vermelhas ou avermelhadas indica uma interação fraca ou falso-positivo. O gene repórter de ADE2 NMY51 só é activada quando se trata de uma interacção proteína-proteína, o que por sua vez bloqueia a acumulação de um corante vermelho nesta estirpe de levedura 40. Na ausência de interacção, NMY51 são avermelhada, enquanto que as colónias possuindo interactores fortes são brancos. A observação da cor das colónias nas placas de selecção proporciona, assim, uma outra sugestão importante para avaliar se as respectivas colónias são interactores ou verdadeiro-falso-positivos. É, eventualmente necessário adaptar ou modificar certas configurações de ensaio no que respeita à natureza do isco e as características de interacção. Até agora, um certo número de melhoramentos e técnicas de derivados do Y2H comum foram estabelecidas para permitir a análise de interacções entre proteínas bastante difíceis em diferentes sistemas hospedeiros. A revisão por Stynen et al. 49 endereços de umnd descreve diferentes aspectos da Y2H, suas melhorias e adaptações, e, portanto, fornece informações úteis sobre como escolher o ensaio de interação adequada. telas y2h e técnicas derivados tornaram-se amplamente utilizado em diferentes campos de pesquisa, onde é necessária a identificação de interações proteína binários. Mesmo se os controles críticos sejam executadas, tais como testes de auto-ativação da isca e um-para-um re-transformações das proteínas que interagem identificados, a Y2H é propenso a produzir falsos resultados 26, 50, 51. A levedura como um modelo não é adequado para todos os estudos de interacção. Levedura não constitui necessariamente um ambiente celular que suporte a modificação pós-tradução adequada e dobrável para todas as proteínas 24. Além disso, na configuração Y2H, as proteínas são sobre-expressos, e a sua expressão não é controleliderados por seu promotor natural. O Y2H obriga os parceiros de interacção proteicos para o núcleo, o qual não é necessariamente o seu destino subcelular natural. As circunstâncias celulares nativas da interação, portanto, não pode ser refletida pela levedura e pode levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos. A maior parte são baseados em Y2H complementação levedura auxotrofia como princípio selectivo. Esta selecção nutricional caracteriza-se por sensibilidade elevada, mas à custa da diminuição da selectividade em comparação com outros (por exemplo, repórter cromogénico) ensaios 49. Se o auto-activação unreducible (ver acima) ou outras limitações ocorrer durante um certo efectora, o Y2H não é um ensaio apropriado 25. Na Tabela 1 e na Figura 1, os resultados esperados do teste de auto-activação são dadas. A ausência de interacções real (isto é, os falsos negativos) pode ser causado pela toxicidade da proteína, a proteína de translação incorrectaprocessamento, o impedimento estereoquímico da interacção, parceiros de interacção sub-representados na biblioteca de presa, a localização da membrana da isca, em falta ou componentes necessários para a interacção 24. Recomenda-se de novo amplificar o gene de comprimento total da proteína que interage identificados a partir de ADNc, subclonar-lo em pGAD-HA, e realizar um ensaio de interacção de um-para-um, transformando o gerado pGAD-HA arquétipo na isca que expressam estirpe NMY51. Isto é necessário uma vez que a observada interactor presente na biblioteca de presa pode ser apenas um fragmento de uma proteína maior. No entanto, a informação para o respectivo gene completo somente é acessível se considerável de dados de sequência genômica e transcriptomic está disponível. O protocolo de transformação para o ensaio de auto-activação descrito aqui pode ser aplicado para um tal ensaio de um-para-um, e a interacção entre a isca e interactor deve ser reprodutível. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interações identificados em uma tela Y2H deve sempre ser confirmado por uma outra técnica independente. Esta técnica independente deve estar mais perto do cenário natural da interação proteína-proteína real. No caso do ATP_00189 phytoplasmal efetoras, a interação com os fatores de transcrição TCP de Malus x domestica foi verificada in planta com complementação fluorescente bimolecular (BiFC) em Nicotiana benthamiana protoplastos 28 (não faz parte deste protocolo). O ATP_00189 proteínas efetoras foi derivado da planta patógeno P. mali. Em BiFC planta foi assim escolhido para verificar as interações ATP_00189 com os fatores de transcrição x Malus domestica anteriormente identificada na Y2H 28. BiFC é um ensaio de interacção proteína-proteína que não requer a translocação subcelular das proteínas que interagem para o núcleo, a fim de activar o sistema repórter &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Além disso, as in planta de expressão e de máquinas modificação imita o ambiente da interação natural entre o efetoras bacteriana planta em sua planta hospedeira. No entanto, uma tela global, utilizando BiFC não é viável. Existem várias etapas no protocolo que deve ser cuidadosamente abordada. Ao amplificar o gene de interesse (Passo 4), é importante excluir a possibilidade de os iniciadores se ligam a DNA da planta. Assim, o ADN a partir de plantas não-infectadas deve ser incluído como um controlo negativo. A sequência do gene de interesse não tem de conter os locais de restrição EcoRI e Sall que são usados ​​para a clonagem direccional do inserto. Se a sequência não conter estes locais, diferentes enzimas de restrição para a clonagem deve ser escolhido. transformação de levedura é um método central durante este protocolo. A eficiência de transfecção depende da competência das células de levedura, a sua viabilidade, o estado de crescimento, e a qualidade do Reag transfecçãoent 53, 54. Para o protocolo proposto, é altamente recomendado o uso de leveduras a partir de placas frescos não mais de duas semanas (mantida a 4 ° C) ao realizar as transformações. Muitas vezes, o crescimento de leveduras transformadas é retardada quando as culturas líquidas selectivos são inoculados com as colónias de placas de agar de idade. É também útil utilizar uma cultura de arranque de líquido como um inoculo para as experiências reais e não usar a levedura directamente a partir da placa. Baixa eficiência quando transfecção da presa em levedura expressando isca pode levar à sub-representação de certas proteínas da presa (potenciais interatores) e pode, assim, deforme toda a tela. Neste protocolo, a eficiência de transfecção de levedura de ~ 150.000 ufc / g de ADN transfectado no Y2H funcionou bem. Conhecer as falhas e os inconvenientes da técnica Y2H e interpretar os resultados de forma crítica e adequada é indispensável para desenhar o correct conclusões. ensaios Y2H e os seus derivados têm sido utilizadas há muitos anos e têm sido objecto de muitas melhorias e adaptações no que respeita às diferentes características de isco, a localização subcelular da interacção, os parceiros de ligação esperados, e outros factores que possam ser necessários para a interacção (ver Y3H 55, 56, 57). Recentemente, telas Y2H baseadas em matrizes que têm sido desenvolvidos para permitir a análise automatizada, de alto rendimento de numerosas iscos contra milhões de presas 58. O futuro provavelmente reside nas abordagens de automatização e de alto rendimento para este ensaio para permitir a elucidação das vias de sinalização complexas e interactoma em diferentes áreas de investigação.

<html> Levedura telas de dois híbridos (y2h) foram desenvolvidos cerca de 27 anos atrás 1 e já foram amplamente utilizado em vários campos para determinar interações específicas proteína-proteína 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . A interacção física de um efector bacteriana com uma proteína alvo do hospedeiro muitas vezes é a condição prévia para a manipulação funcional desta proteína alvo. Analisando essas interações mudou-se para o foco de diversos setores da infecção biologia 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. O princípio da tela de Y2H é que a interacção entre duas proteínas leva à reconstituição de um factor de transcrição funcional, que dirige a expressão de genes repórter. O efector conhecido (o&quot; isco &quot;) é fundida na tradução com para o domínio de ligação de DNA (DBD) do factor de transcrição, e os potenciais parceiros de interacção (o &quot;presas&quot;) está fundida com o domínio de activação (AD) do respectivo factor de transcrição. uma vez que o parceiro de interacção é desconhecida, uma biblioteca de potenciais interactores é clonado no assim chamado &quot;presa-biblioteca&quot;. Normalmente, esta biblioteca é feita por clonagem de ADNc num plasmídeo adequado expressão presa vector que codifica o anúncio que é compatível com a isca-vector codificado DBD. no caso de uma interacção, o factores de transcrição reconstituída induzir a expressão de genes repórter, que geralmente permitem a selecção de crescimento de levedura. oidentificação dos interactores é obtida por sequenciação do plasmídeo presa com iniciadores específicos para o plasmídeo. As bactérias desenvolveram várias estratégias para manipular e explorar o metabolismo do seu hospedeiro ou para fugir mecanismos de defesa e secretam moléculas efetoras através de diferentes sistemas de secreção bacterianas 19, 20, 21. Determinando os parceiros de ligação destes efectores bacterianas é, assim, o primeiro passo para identificar a via manipulada no hospedeiro. Isto leva a uma melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade específicos. Y2H telas são realizadas para identificar interacções bacterianas efectoras durante phytoplasmoses, e, muitas vezes, Y2H é uma experiência inicial crucial para a posterior caracterização dos mecanismos moleculares de patogenicidade em investigação phytoplasma 22, 23. No entanto, o metA inscrição hod na maioria das publicações é bastante escassa, e essas técnicas muitas vezes são terceirizadas para empresas de biotecnologia. Para chamar a atenção para a viabilidade deste método, este protocolo fornece informações passo-a-passo para identificar parceiros de interação de uma molécula efectora bacteriana em seu hospedeiro natural. Apesar da ampla utilização e a abordagem de avanço rápido de telas y2h, não se deve esquecer que certas interações podem não ocorrer no sistema de levedura. Isto é devido ao facto de a célula de levedura é usado como uma espécie de &quot;in vivo vaso de reacção&quot; com certas limitações biológicas. Vários autores têm abordado as vantagens e desvantagens de Y2H e seus derivados 11, 24, 25, 26, 27. Considerações gerais são, por exemplo, que a célula de levedura pode não proporcionar a adequadaa expressão do gene, (pós-) translacional, ou condições translocational para as respectivas proteínas em estudo. Isso pode levar a resultados falso-negativos na tela. Interacções positivas podem por sua vez ser artefactos e pode não ocorrer na situação natural (ou seja, em caso de efectores no hospedeiro apropriado). É, portanto, indispensável para confirmar as interacções do sistema de expressão de levedura heteróloga com um teste de interacção independente num sistema biológico mais intimamente relacionados. Neste estudo, foram identificados os parceiros de ligação do ATP_00189 efetoras do patógeno de planta não-cultiváveis Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Os resultados fornecem importantes insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento dos sintomas da proliferação de maçã 28, uma doença que causa grandes perdas econômicas em regiões de cultivo de maçã afetados na Europa 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Desvendando os mecanismos moleculares de manifestações da doença é importante compreender patologias e desenvolvimento de sintomas em ciência das plantas. As bactérias têm evoluído diferentes estratégias para manipular seu metabolismo de acolhimento para seu próprio benefício. Esta manipulação bacteriana é muitas vezes associada com o desenvolvimento de sintomas graves ou a morte das plantas afetadas. Determinar as moléculas responsáveis ​​bacterianas específicas para a manipulação de acolhimento tornou-se um importante campo de pesquisa microbiológica. Após a identificação destas moléculas bacterianas, chamados &quot;efectores,&quot; é importante para elucidar a sua função. Uma abordagem simples para determinar a função de um efector é identificar o seu parceiro de ligação proteináceo no seu hospedeiro natural através de uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H). Normalmente, o anfitrião abriga numerosos parceiros de ligação potenciais que não podem ser previstos suficientemente por qualquer algoritmo em silico. É, portanto, a melhor escolha para perform a tela com o efetor hipotética contra toda uma biblioteca de proteínas do hospedeiro expressas. É especialmente difícil se o agente causador não é cultivável como fitoplasma. Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para a purificação de DNA a partir de uma planta infectada-fitoplasma acolhimento lenhosa, a amplificação do effector potencial, bem como a identificação posterior de parceiro de interacção molecular da planta com uma tela Y2H. Apesar de telas y2h são comumente usados, há uma tendência de terceirizar essa técnica para empresas de biotecnologia que oferecem o serviço Y2H a um custo. Este protocolo fornece instruções sobre como executar uma Y2H em qualquer laboratório de biologia molecular decentemente equipados usando técnicas de laboratório padrão.

Antes da tela Y2H real pode ser realizada a isca deve ser testada para a auto-activação. Isto é conseguido através da transformação do vector de expressão de isca em conjunto com o vector vazio biblioteca presa e verificar o crescimento em placas selectivas. Para analisar se o ATP_00189 proteína phytoplasmal é auto-activação, o teste de auto-ativação foi realizada como descrito no capítulo 5. O plasmídeo isca está complementando o trp ea presa plasmídeo a auxotrofia leu de S. cerevisiae NMY51 40. Um co-transformação bem sucedida é assim caracterizada por crescimento em placas selectivas e falta Trp Leu. Interação da isca e uma proteína presa leva a uma complementação do seu e ade auxotrofia de NMY51. Se a auto-activação da isca na ausência de uma interacção parece, a levedura cresce em placas selectivas e a sua falta ADE. auto-fortes e fracosactivação pode ocorrer. auto-activação forte da isca é caracterizada por um crescimento da levedura co-transformadas em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. auto-activação fraco leva ao crescimento em Trp-Leu-His mas não em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. controlos positivos adequados são indispensáveis ​​para a interpretação dos resultados do ensaio de auto-ativação. Um resumo dos resultados esperados do ensaio de auto-activação e a sua interpretação é fornecida na Tabela 1 e visualizado na Figura 1. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figura 1: Exemplo de Isca testes de auto-ativação de uma isca antes de executar uma tela Y2H. S. cerevisiae NMY51 foi co-transformada com interagindo isca (Plex-p53) e presa (PACT-larget) como um controlo positivo (painel esquerdo: ac), uma fraca auto-ativação, mais uma presa vazia libravector ry (painel do meio: df) e uma isca não é auto-ativação, mais um vector de biblioteca presa vazio (painel direito: gi). A levedura co-transformadas foram cultivadas em placas de SD falta trp e leu (painel superior: a, d, g), Trp, Leu e seu (painel do meio: b, E, H) e Trp, Leu, His e ade (inferior painel: C, F, I). Selecção no meio sem trp e leu é um controlo positivo para a co-transformação bem sucedida, tal como o vector isco complementa a auxotrofia trp e o vector presa a auxotrofia de NMY51 Leu (crescimento em SD-Trp-Leu). Em caso de uma interação entre a isca e presa ou uma auto-ativação da isca, a expressão repórter de NMY51 está ligado e complementa o dele e auxotrofia ade (crescimento em SD-trp-leu-a-ade). Uma fraco de auto-activação é caracterizado por um crescimento em SD-Trp-Leu-suas placas (painel do meio, DF). auto-ativação fraca de uma isca deve ser diminuída prévia para analisar a iscaem uma tela Y2H, por exemplo, adicionando 3-AT para a mídia seletiva. esgotamento de aminoácidos são indicados com &quot;-&quot;, no respectivo nome do papel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> Nenhum </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> Nenhum </td><td> pGAD-HA </td><td> nenhum crescimento </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> Nenhum </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td&gt; colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> pacto de larget </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> colónias </td><td> nenhum crescimento </td><td> nenhum crescimento </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resultados esperados em um ensaio de auto-ativação isca. A transformação de S. cerevisiae NMY51 produz no crescimento diferencial em meios selectivos com base nas características de isca co-transformado e presa. O crescimento em placas selectivas foi avaliada mediante a transformação de diferentes combinações de vectores (AF) após 72 h de incubação a 30 ° C. auto-activação fraco é caracterizado pelo crescimento de levedura em SD-Trp-Leu-His e auto-activação forte por crescimento em SD-Trp-Leu-His-ade plat selecçãoes na ausência de um parceiro de interação. O pLexA-N phytoplasmal codificado efectora ATP_00189 não exibem auto-activação, que se caracteriza pela incapacidade do vector isco transformado NMY51 para crescer na ausência da sua e ade. Dependendo do isco, uma tela Y2H pode obter numerosos clones de levedura que crescem em placas selectivas. Todos os clones devem ser analisados ​​e verificados para possíveis redundâncias. Mesmo se uma biblioteca de cDNA normalizada foi usado, é muito provável que um interactor é representado em muitos clones diferentes. Dependendo da técnica de clonagem de biblioteca, é também possível que apenas os fragmentos do gene completo, são inseridos em vectores de algumas presas. Assim, é aconselhável para amplificar de novo (a partir de ADNc) e subclonar o gene de comprimento completo do interactor e para testar a interacção de uma análise Y2H um-para-um (Figura 2). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Exemplo de uma interação entre Bait and Prey Em um experimento Y2H. Uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H) foi realizado e os plasmídeos dos clones positivos foram purificados interactors. O vector presa foi sequenciado e foram identificados os Malus x domestica parceiros de interacção hospedeiro MdTCP24 e MdTCP25. Como um controlo negativo MdTCP34 (para os quais não foi identificado interactor no rastreio da biblioteca Y2H) foi subclonado em paralelo. Os genes de comprimento total foram amplificados a partir de ADNc de maçã, subclonado no vector de presa (co-cistronically expressando o domínio AD activação) e de novo co-transformada com o vector isco expressando o ATP_00189 efectora bacteriana acoplado ao domínio de ligação ao ADN (BD). Este valor é retirado a partir de 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior</a>versão desta figura.

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K visualizações.  Laimburg Research Centre.  proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares. 

Vídeo: Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Imunologia e Infecção

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasão das células humanas por um agente patogénico

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

A separação automática de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variably Colonizada por um patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis meio de uma levedura Screen Two-hybrid