Este projeto foi o apoio, em parte, pela Johns Hopkins University, Gabinete do Reitor através da Iniciativa Ciência Gateway e Qiagen Inc.

Introdução: Uma única colónia bacteriana deve ser usada para inocular um meio de cultura adequado que é incubado durante a noite. Um pelete bacteriana é então processado para purificar ADN genómico usando um kit de isolamento genómico disponíveis comercialmente. O ADN genómico purificado deve ter uma proporção de 260/280 (nm)&gt; 1,8 para assegurar que a amostra está isenta de contaminação de proteína. A quantidade de ADN genómico requerido para a geração do modelo pirosequenciamento é de 10-20 ng. A. Ampliação do Modelo de (PyroMark Handbook PCR; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / manuais</a> 1) Configurando a reação de PCR Nota: Uma cartilha deve ser biotinilado na sua extremidade 5 &#39;, e é recomendado que seja HPLC purificada para elaboração do modelo. Recomendamos o PyroMark Ensaio Projeto Software 2.0 para PCR e sedesenho de primers cia que são otimizados para o seqüenciamento de curto leitura, no entanto, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) do NCBI também pode ser utilizados para o desenho de primers. <ol><li> Descongelar todas as soluções necessárias (listadas na Tabela 1) e misturar completamente cada. Configure a reação de acordo com a Tabela 1. Todo o trabalho pode ser realizado à temperatura ambiente. </li></ol> Nota: A PCR Master Mix contém MgCl2 para uma concentração final de 1,5 mM, o que proporciona resultados satisfatórios, na maioria dos casos. Se um maior Mg 2 + a concentração é necessária, até 3,5 ul de 25 mM de MgCl 2 pode ser adicionado a uma reacção. <ol start="2"><li> Misture a mistura de reacção pipetando suavemente para cima e para baixo, então dispensar volumes adequados em tubos de PCR. </li><li> Adicionar template ADN de cada tubo de PCR. Recomendamos 10 ng de DNA genômico. </li><li> Programar o termociclador de acordo com a Tabela 2. Um porão definitivo a 4 ° C, para conveniência. Se estiver usando um termociclador sem tampa aquecida, reações de sobreposição com 100 mL de óleo mineral. </li><li> Coloque os tubos de PCR no termociclador e iniciar o programa de ciclismo. </li></ol> B. Vacuum Protocolo Workstation Imobilizar os produtos de PCR biotinilados <ol><li> Faça uma mistura mestre de acordo com a Figura 4. </li></ol> Nota: Antes de pipetagem, agite o frasco de contas Sepharose streptavidin revestidos para garantir uma suspensão homogénea. <ol start="2"><li> Dependendo do volume de produto de PCR utilizado, dispensar 60-75 ul mistura principal em cada poço de uma placa de PCR para produzir um volume total de 80 uL por poço. </li><li> Adicionar 5-20 ul do produto de PCR biotinilado a cada poço. </li><li> Selar os poços com tira caps e agitar a placa de PCR a 1.400 rpm durante 5-10 min à temperatura ambiente (15-25 ° C), utilizando um agitador orbital. </li></ol> A desnaturação de ADN e adição de iniciador de sequenciação <ol><li> Dilui-se os iniciadores de sequenciação a 0,3 uM com tampão de recozimento e dispensar 25 ul em cada poço de uma placa de reacção. Posicione a placa na estação de trabalho. </li><li> Preencha os bebedouros de estações de trabalho de acordo com o diagrama da Figura 5. </li><li> Ligue a bomba de vácuo, e verifique se a chave na ferramenta de vácuo é ativada (Figura 6). Lave as sondas do filtro com água de elevada pureza (Milli-Q cm x 18,2 MW ou equivalente) na calha 5 (Figura 5). Encher o cocho com água de alta pureza fresca para uso na etapa 12. </li><li> Trabalhando rapidamente, posicionar a placa de PCR com contas na estação de trabalho. Assegure-se que ambas as placas estão na mesma orientação que quando as amostras foram carregadas. </li><li> Com o interruptor de vácuo ON, diminuir o vácuoferramenta para os poços da placa de PCR de 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. As pérolas serão capturadas pela ferramenta de vácuo (Figura 7). </li><li> Com o vácuo ainda ON, lave a ferramenta com etanol 70% (trough 1) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li><li> Com vácuo ON, lave a ferramenta com solução de desnaturação (trough 2) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li></ol> Nota: A solução de desnaturação contém hidróxido de sódio, que é um irritante da pele e dos olhos. Sempre usar um jaleco, luvas e óculos de proteção. <ol start="8"><li> Com vácuo ON, lave a ferramenta com tampão de lavagem (calha 3) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li><li> Com vácuo ON, levantar a ferramenta vácuo para além de 90 ° na vertical por 5 segundos, para permitir que todo o líquido escorrer para fora da ferramenta de vácuo. Desligar a bomba, e alinhar a ferramenta de vácuo com a placa de reação. Baixe a ferramenta de vácuo nopoços e agitar suavemente de um lado para outro para liberar as contas nos poços contendo cartilha seqüenciamento. </li><li> De modo a limpar a ferramenta de vácuo, agitar as sondas de filtro com água de elevada pureza (calha 4) durante 10 seg. </li><li> Desligue o vácuo ON e limpar a ferramenta com água de alta pureza (trough 5) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li><li> Levante a ferramenta vácuo para além de 90 ° C vertical, por 5 segundos, em seguida, mudar o vácuo OFF e armazenar na posição &quot;Parking&quot;. </li></ol> Recozimento cartilha sequenciamento de cadeias de DNA <ol><li> Colocar a placa de reacção em um suporte da placa pré-aquecida. </li><li> Aquece-se a placa num bloco de aquecimento a 80 ° C durante 2 min. </li><li> Remova a placa do suporte e coloque em cima do balcão para esfriar em temperatura ambiente por 5 min. </li></ol> Pyromark Q24 Operação Nota: Ligue o instrumento usando o interruptor localizado acima do cabo de alimentação. Estrelatup pode levar até 1 min. <ol><li> Encher um cartucho de acordo com as instruções fornecidas no PyroMark Ouro Q24 Reagentes Manual 2. Para determinar volumes necessários, configurar um arquivo executado no software do aparelho, e no menu Ferramentas, selecione Pré Informações Run </li><li> Se o instrumento já estava, verifique se ele não está realizando uma corrida e, em seguida, abra a tampa. Um sinal de aviso sonoro será emitido se a tampa é aberta quando não é seguro para o fazer. </li><li> Abra a porta do cartucho e insira o cartucho com o rótulo virado para a frente (Figura 8). Certifique-se de que o cartucho está inserido corretamente (a linha deve ser visível na parte da frente) e fechar o portão. </li><li> Abra a moldura da placa de retenção e posicionar a placa com as amostras dentro do instrumento. </li><li> Feche a moldura da placa de retenção ea tampa do aparelho (Figura 9). </li></ol> Iniciando uma corrida <ol><li> Insira o pendrive com o arquivo runs criadas com o software do instrumento na porta USB na parte da frente do aparelho. </li><li> Selecione &quot;Run&quot; no menu principal e pressione &quot;OK&quot;. </li><li> Use as setas de rolagem para selecionar o arquivo de execução desejado e pressione &quot;Select&quot;. </li></ol> Nota: O aparelho começará a distribuição de reagentes, quando toda a pressão pré e níveis de temperatura são alcançados (isso pode levar alguns minutos). Durante o funcionamento, o instrumento tela exibe o pyrogram do bem seleccionada em tempo real. Use as setas de rolagem para visualizar o pyrogram de outros poços. Completar uma corrida <ol><li> Quando o instrumento confirma que o prazo terminou eo arquivo de executada, foi salvo no pendrive, clique em &quot;Fechar&quot;. </li><li> Retire o stick USB. Se ele foi removido antes do prazo terminar, insira o stick USB. Selecione &quot;Administração&quot; e depois em &quot;Copy é executado não salvos&quot;. </li><li> O arquivo de correr agora podem ser abertos e analisados ​​usando o software do aparelho e comparadosde uma biblioteca de micróbios conhecidos utilizando o software Identifire. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Qiagen. Autores Ahmed, Durocher, Jessen e Vardi são funcionários da Qiagen Inc., que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Vários novos métodos de sequenciamento de próxima geração foram comercializados. Três dos métodos mais utilizados são semicondutores seqüenciamento de íons, única molécula de sequenciamento em tempo real, e seqüenciamento por síntese (SBS). 3-11 Cada um desses métodos depende de seqüenciamento por síntese, mas empregar novas plataformas para a detecção dos nucleotídeos incorporados. No ião semicondutor sequenciação, uma cadeia simples de DNA serve como um molde para a cadeia de sequenciação. Polimerase e 12 nucleótidos são adicionados sequencialmente, tal como no pyrosequencing. Quando um nucleótido é adicionado à crescente cadeia de ADN, um ião de hidrogénio é libertado. O ião de hidrogénio é detectado por um sensor baseado em transistores de efeito de campo. Única molécula de sequenciação em tempo real depende do modo de guia de ondas de zero (ZMW). ZMW 13 A é uma pequena estrutura em que uma única molécula de polimerase é ligado ao fundo do poço. Ele é iluminado de tal maneira que uma floremolécula de perfume pode ser detectado. Cada nucleótido é marcado com uma molécula fluorescente. Como um nucleótido marcado é incorporado por fluorescência, um detector identifica as sequências de nucleótidos. Quando o próximo nucleótido é adicionada, a molécula fluorescente é clivada 14. Sequenciação por síntese (SBS) utiliza um método único para amplificar o DNA alvo de tal modo que os conjuntos de sequências únicas são gerados. De 15 modelos de cadeia simples são geradas e, em seguida, a cadeia complementar é sintetizado. Cada nucleótido é marcado com uma molécula fluorescente e depois de cada adição de base da fluorescência de base adicionada é gravado.

Pyrosequencing é um método rápido e preciso de sequências de ácidos nucleicos que se baseia no princípio de &quot;sequenciação por síntese&quot;. &quot;Sequenciação por síntese&quot; envolve o uso de um único molde de ADN para sintetizar a cadeia complementar uma cadeia de base de cada vez, e detectando a base incorporada (A, T, G ou C) em cada passo, por detecção de um sinal quimioluminescente. A reacção pirosequenciamento inclui ADN molde, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), polimerase de ADN, sulfurilase de ATP, a luciferina, a luciferase e a apirase. A reacção de síntese é iniciada pela adição de um dos quatro dNTPs e DNA polimerase a um único molde de ADN de cadeia simples biotinilado. Polimerase de ADN incorpora o dNTP complementar para o molde, com a subsequente libertação de pirofosfato (Figura 1). Sulfurilase de ATP proporcionalmente converte o pirofosfato de ATP. ATP actua como um catalisador para a conversão mediada pela luciferase de luciferina para oxiluciferina, o qualgera luz (Figura 2). A intensidade da luz é proporcional ao número de nucleótidos incorporados e determina se está presente na cadeia molde sequencialmente (Figura 3) uma ou mais específico do dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Qualquer dNTP não incorporada é degradada pela apirase, antes da adição do próximo dNTP para a continuação da reacção de síntese. Este &quot;sequenciação por síntese&quot; reacção é repetida com a adição de cada um dos quatro dNTP até a sequência de ADN do molde de ADN de cadeia simples é determinado. Para ver uma animação da reação pirosequenciamento <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyrosequencing é uma técnica versátil, que facilita a sequenciação do genoma microbiano que pode ser utilizado para identificar espécies bacterianas, discriminar estirpes bacterianas e detecção de mutações genéticas que conferem resistência a agentes anti-microbianos. As vantagens de pirosequenciamento para aplicações de microbiologia incluem high-throughput screening rápido e confiável e correta identificação de micróbios e mutações do genoma microbianas. Pyrosequencing envolve a sequenciação de ADN, sintetizando a cadeia complementar de uma única base de cada vez, enquanto que a determinação do nucleótido específico ser incorporada durante a reacção de síntese. A reacção ocorre em imobilizada único molde de ADN de cadeia simples onde os quatro desoxirribonucleótidos (dNTP) são adicionados sequencialmente e os dNTPs não incorporados são degradados enzimaticamente, antes da adição do próximo dNTP para a reacção de síntese. Detecção da base específica incorporada no molde é monitorizada por geração de chemilumsinais inescent. A ordem dos dNTPs que produzem os sinais quimioluminescentes determina a sequência de ADN do molde. A capacidade de sequenciação em tempo real de pyrosequencing tecnologia permite a identificação microbiana rápido num único ensaio. Além disso, o instrumento pirosequenciamento, pode analisar a diversidade genética completa de resistência às drogas anti-microbianas, incluindo a tipagem de SNPs, mutações pontuais, inserções e deleções, bem como a quantificação de múltiplas cópias do gene que podem ocorrer em alguns resistência anti-microbiana padrões.

Os resultados de uma corrida pyrosequencing típica utilizando o programa mostra a localização dos iniciadores para a frente e reverso usados ​​para a geração do fragmento amplificado, e o iniciador de sequenciação utilizada para a reacção dentro do pyrosequencing 16S ribossomal sequência conservada (Figura 10). Hipervariável A sequência entre o primer locais permite a identificação de bactérias de um grande número de espécies bacterianas utilizando o iniciador de sequenciação conservada (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Como um controlo interno de qualidade, a sequência de variação de ADN da região variável pode ser verificado para assegurar que a região de DNA correcta foi analisado . O software pirosequenciamento permite a comparação e alinhamento da sequência gerada a uma base de dados interna de sequências ribossomais bacterianas para identificação bacteriana. Além disso, uma sequência pode ser analisada para determinar as mutações que conferem resistência ao antibiótico. Por exemplo, a análise de mutações nos genes ribossomais 23S do Helicobpylori acter demonstra dois padrões de mutação (ou AGA GAA) que conferem resistência aos antibióticos (Figura 11). Análise dos vários isolados do mesmo paciente pode ser ensaiada simultaneamente para controlar o aparecimento de resistência a drogas ao longo do tempo para auxiliar em investigações epidemiológicas dos surtos microbianas de resistência a drogas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figura 1. Produto de PCR biotinilado é usado como um modelo para incorporar dNTPs por polimerase do ADN, conduzindo à geração de pirofosfato (PPi). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figura 2. Sulfurilase de ATP proporcionalmente converte pirofosfato de ATP actos ATP. Como um catalisador para a conversão mediada pela luciferase de luciferina para oxiluciferina, o que gera luz que é próproporcional à quantidade de ATP. A luz é registada como o pico do traçado pyrogram e indica a incorporação de nucleótidos. Os dNTPs não incorporados são degradados pela apirase antes do próximo dNTP é adicionado para a continuação da síntese. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figura 3. A intensidade de luz gerada indica se foi incorporado um ou mais específico do dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP) na cadeia molde sequencialmente. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Figura 4. Fluxograma para preparação de mestre mix para imobilizar o produto PCR biotinilado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Figura 5. PyroMark estação de trabalho, com placa de PCR, placa PyroMark e locais da calha. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Figura 6. Localização da chave de vácuo ON e OFF posições. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figura 7. Ferramenta de vácuo. Tratamento adequado da ferramenta de vácuo. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figura 8. Cartucho portão se abriu com o cartucho no lugar. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Figura 9. Cartucho inserido corretamente com portão fechado. &quot;Fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> Figura 10. Pyrosequencing bacterianos baseados em resultados de identificação. Iniciadores de PCR foram concebidos para regiões conservadas do molde de ADN, e o iniciador de sequenciação está posicionado imediatamente a montante de uma sequência de ADN de identificação hipervariável bem caracterizados no âmbito do amplicão (mostrado em azul). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Figura 11. Detecção de resistência aos medicamentos antibióticos em Helicobacter pylori utilizando pyrosequencing. Análise de mutações nos genes 23S que conferem resistência antibacteriana em Helicobacter pylori contendo GAA ou seqüências AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Componente </td><td> Volume por reação </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 mL </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Concentrado CoralLoad, 10x </td><td> 2,5 mL </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM de MgCl 2 (opcional) </td><td> Variável </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (opcional) </td><td> 5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / B Primer </td><td> Variável / Variável </td><td> ΜM/0.2 0,2 ​​mM </td></tr><tr><td> Água RNase </td><td> Variável </td><td> - </td></tr><tr><td> Volume total (após a adição de ADN-alvo) </td><td> 25 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Mistura de reacção de PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Comentários adicionais </td></tr><tr><td> Passo de activação inicial de PCR </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA polimerase é ativado </td></tr><tr><td> 3 etapa de ciclismo: desnaturação </td><td> 30 seg </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Recozimento </td><td> 30 seg </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Para obter ADN genómico Para bisulfite DNA convertido </td></tr><tr><td> Extensão </td><td> 30 seg </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Número de ciclos </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Extensão final </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Especificações do ciclo de PCR.

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Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing é uma técnica versátil, que facilita a sequenciação do genoma microbiano que pode ser utilizado para identificar espécies bacterianas, discriminar estirpes bacterianas, e detectar mutações genéticas que conferem resistência a agentes anti-microbianos. Neste vídeo, o procedimento para a geração microbiana amplicon, amplicon pyrosequencing, e análise da seqüência do DNA será demonstrado.

Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

46.9K visualizações.  Johns Hopkins University. Pyrosequencing é uma técnica versátil, que facilita a sequenciação do genoma microbiano que pode ser utilizado para identificar espécies bacterianas, discriminar estirpes bacterianas, e detectar mutações genéticas que conferem resistência a agentes anti-microbianos. Neste vídeo, o procedimento para a geração microbiana amplicon, amplicon pyrosequencing, e análise da seqüência do DNA será demonstrado.

Vídeo: Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Comunidades microbianas na Natureza e Laboratório - Entrevista

Biologia

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologia de comunidades microbianas - Entrevista

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Análise do promotor de planta: Identificação e caracterização de raiz nódulo promotor específico no feijão comum

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificação, Isolamento e Caracterização de Progenitores Fibro-Adipogênicos (FAPs) e Progenitores Miogênicos (MPs) em Músculo Esquelético no Rato

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

Em Silico Identificação e caracterização de circRNAs durante interações patógeno-hospedeiro

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...