Este trabalho foi apoiado pelo arranque fundos da Universidade de Nova Iorque. Agradecemos Maitreya Dunham e Matt Brauer, que inicialmente desenvolveu o uso de biorreatores Sixfors como quimiostatos.

O princípio da cultura contínua usando um quimiostato pode ser realizado em uma variedade de implementações. Em todos os quimióstatos é essencial ter um) métodos para manter a esterilidade de todos os componentes, 2) uma cultura bem misturada, 3) arejamento adequado do vaso de cultura e 4) um meio confiável de adição e remoção de meios de cultura. Aqui, descrevemos a utilização de um bioreactor de Sixfors (Infors Inc) como um quimiostato utilizando métodos que podem ser prontamente adaptados para configurações alternativas. 1. Montagem das embarcações chemostat <ol><li> Ligue os Sixfors usando o interruptor principal. </li><li> Lave bem o recipiente chemostat, montagem agitador, e tubos ligados com deionizada (DI) de água. Confira toda a tubulação e o-rings e substituir quaisquer peças desgastadas procurando. </li><li> Certifique-se a base de apoio veio de accionamento está virada para cima no recipiente de vidro e que a parte superior do veio de accionamento é encaixado no seu alojamento no conjunto agitador. Defina o stirremontagem r-se no reactor de vidro assegurando a parte inferior do veio de accionamento está encaixado no suporte de eixo rígido. Use o grampo para fixar o conjunto do agitador para o recipiente de vidro. </li><li> Encher o vaso com cerca de 300 ml de água DI. </li><li> Retire as tampas de um oxigênio dissolvido (OD 2) sonda e verificar o nível do eletrólito, desapertando a carcaça inferior e certificando-se de que a caixa do fundo está cheio até a metade com solução eletrolítica. Rescrew o revestimento inferior e inserir na porta do navio chemostat. Aperte até dedo apertado. </li><li> Dê uma sonda de pH e removê-lo de seu buffer de armazenamento (3 M KCl). Retire a tampa da sonda de pH e anexar ao fermentador 1. Usando a tela de controle Sixfors, navegue até o menu de parâmetros de fermentação e selecione &quot;calibrar pH&quot;. Coloque a sonda de pH em um buffer padrão pH 7 e registre a leitura como alta Read. Repita com tampão pH 4 e registre a leitura como Low Read. Retire a sonda de pH do fermentador, lavar com água DI e introduzir a sonda into porto no navio chemostat. Aperte até dedo apertado. </li><li> Colocar o recipiente chemostat no rack. Nota sobre a embarcação que fermentador (1-6) a sonda de pH foi conectada e calibrado. Coloque a tampa da sonda de pH na sonda de pH. Usando folha de cobrir bem a parte superior da sonda DO 2. </li><li> Dobrar a folha ao longo das extremidades do tubo ligado ao recipiente de quimiostato. </li><li> Repita os passos de 1,2-1,8 para todas as embarcações. </li><li> Esterilizar por autoclavagem dos vasos lhes durante 15 minutos num ciclo de líquidos. </li></ol> 2. Preparação da mídia <ol><li> Estabelecer a faixa-limite de concentração de um nutriente por uma crescente cultura de lotes em diferentes concentrações de nutrientes. O nutriente é limitante na gama em que a densidade celular final é uma função linear da concentração de nutrientes inicial (Figura 4). Selecione uma concentração de nutrientes bem dentro da faixa de limitação. Exemplos de composição de mídia padrão para estudos com Saccharomyces cerevisiae estão disponíveis em 7-11. </li><li> Autoclave um garrafão vazio que é tapado com uma rolha de borracha que contém uma entrada de ar e meios de saída após a primeira assegurando que a extremidade do tubo de media está coberta em folha. </li><li> Em um recipiente separado preparar 10 L de meios de comunicação. </li><li> Coloque uma xícara de 500 ml de filtro para um frasco de 100 ml de mídia. Retire o filtro de algodão com uma pinça esterilizados em etanol e anexar imediatamente à porta filtração no garrafão mídia. </li><li> Prenda o garrafão de mídia a uma fonte de vácuo e filtro de esterilizar mídia, adicionando-o ao copo do filtro. </li><li> Quando filtração dos meios de comunicação é completa, fechar a porta de filtração com uma braçadeira de metal. </li></ol> 3. Calibrar fazer 2 Sondas e Configurando chemostat <ol><li> Depois de os vasos em quimiostato foram autoclavados e deixou-se arrefecer o lugar do navio no seu revestimento de calor correspondente. Ligue o sensor de temperatura, sonda de pH, e fazer 2 sonda. Deixe onavio sentar-se com o poder por pelo menos 6 horas para permitir que os fazer 2 sondas de polarizar. </li><li> Coloque a extremidade de cada tubo de efluentes em um receptáculo de coleta separado. Conecte o suprimento de ar através de um filtro autoclavado e ativar o fluxo de ar. A água em cada navio deverá sair dos tubos de efluentes, o que indica que todos os selos são devidamente formado. </li><li> Ajustar a altura do tubo efluente de acordo com o volume de trabalho desejado (por exemplo, 300 ml). Usamos uma régua que está marcado com a colocação de tubos calibrados para diferentes volumes de trabalho. </li><li> Conecte o garrafão de mídia para o navio chemostat. Use etanol, a fim de manter o tubo termina como estéril quanto possível. Passe a tubulação da bomba através da bomba e pinça aberta. Pressionar manualmente a bomba até que a mídia começa a fluir para dentro do vaso chemostat. Solte a tubulação da bomba, a mídia deve fluir livremente para dentro do vaso chemostat. Quando a mídia atinge o tubo de efluentes, recoloque a tubulação à bomba e pinça. </li><li> Comece running o programa básico com impulsor conjunto a 400 rpm e a temperatura fixada em 30 ° C. </li><li> Para calibrar fazer 2 sondas, desligue o suprimento de ar e mudar para o gás nitrogênio. Espere pelo menos uma hora e registro de valor medida como &quot;baixo de leitura&quot;. Volte para o fornecimento de ar (ou seja, contendo concentração de oxigênio ambiente), espere pelo menos uma hora e medição registro como &quot;alta de leitura&quot;. </li><li> Iniciar a gravação de dados usando o software Iris. </li></ol> 4. Inoculação <ol><li> Usar 70% de etanol para esterilizar a parte superior do vaso de cultura. </li><li> Remover o parafuso na parte superior do vaso e pipeta de 1 ml de uma cultura durante a noite para dentro do vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso. </li><li> Indique o tempo de inoculação em Iris. </li><li> Espere cerca de 24 horas para que as culturas para atingir fase estacionária adiantada. À medida que a cultura cresce, oxigênio dissolvido e pH diminuirá. No caso dos meios de limitação de glucose, oxigénio dissolvido voltará a ~ 100% em pha estacionáriasi. Por outras limitações nutricionais oxigénio dissolvido permanecerá &lt;100% na fase estacionária. </li></ol> 5. Iniciando Bombas e Atingir estado estacionário <ol><li> A taxa de diluição é calculada dividindo o caudal (quanto mídia flui para dentro do vaso por hora) através do volume de cultura. Por exemplo, usando um volume de 300 ml, uma taxa de diluição de 0,1 significa que 30 ml de meio é adicionada à cultura a cada hora. Uma vez que o sistema se encontra sob pressão positiva o mesmo volume é removido a partir do vaso de assegurar que a cultura é continuamente diluído. Uma gama de taxas de diluição (D) pode ser usado, que não excedam a taxa máxima de crescimento (μ max) das células, acima do qual as células serão lavadas para fora do chemostat. </li><li> Escolha as configurações de bomba, que especificam o número de segundos a bomba é ligado e desligado, para estabelecer a vazão desejada. A bomba fornece meios de comunicação, a uma taxa de ~ 0,11 ml / seg. </li><li> Definir um programa usando o Sixfors interface que especifica o tempo da bomba, a temperatura ea velocidade do rotor. Inicie o programa. </li><li> Esvazie os recipientes de coleta de líquido e registrar o tempo. </li><li> Depois de pelo menos duas horas, utilizar uma proveta para medir a quantidade de meios de comunicação tenha sido removido a partir do vaso. Isto será igual ao volume que foi adicionado ao recipiente de quimiostato. Calcular a taxa de diluição (D = V efluentes / V Cultura / tempo). Ajuste as configurações da bomba se a taxa de diluição calculada não coincide com taxa de diluição desejada. </li><li> No estado estacionário, a densidade celular no quimiostato não muda ao longo do tempo. Isto pode ser medido sem perturbar a cultura através da amostragem do fluxo de saída. Nós operacionalmente definir atingir o estado estacionário como medições da densidade de células idênticas que são separadas por pelo menos uma duplicação da população. Alcançando estado estacionário levará aproximadamente oito gerações de cultura após o início da diluição da cultura. No estado de equilíbrio, as células crescem exponencialmente (i.e. taxa de crescimento constante ao longo do tempo), em condições limitadas em nutrientes. O tempo de duplicação da população (tempo de geração) é ln (2) / D. </li><li> Continuar a medir periodicamente efluentes para a duração da experiência para assegurar que uma taxa de diluição é mantida constante. </li></ol> 6. Aplicação 1: estudar as células a crescer a taxas diferentes em condições de estado estacionário <ol><li> No estado estacionário no quimiostato, a taxa de crescimento da população de células é igual à taxa de diluição. Ao alterar sistematicamente a taxa de diluição é possível cultivar células em taxas diferentes. Isso permite que o estudo sistemático de parâmetros fisiológicos que variam de acordo com a taxa de crescimento, incluindo o volume da célula, o estágio do ciclo celular e resistência ao estresse. Além disso, os perfis de estado estacionário de ARNm globais, proteína e níveis de metabolito pode ser ensaiada em células em crescimento em taxas diferentes. Há duas maneiras de adquirir amostras: </li><li> Pequenas amostras podem ser passivamente obretidos pela colocação da extremidade do tubo efluente em um tubo de 1,5 ml ou 15 ml. Uma amostra de 1-5 ml pode ser obtido em poucos minutos (dependendo da velocidade de fluxo). Muitos parâmetros fisiológicos pode ser medido a partir dessas amostras. </li><li> Expressão de genes, ou de metabolito análises exigem maiores amostras que devem ser obtidos mais rapidamente possível. Coloque a extremidade do tubo efluente em um tubo cónico de 15 ml. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurrar para baixo suavemente. A ~ 10 ml de amostra vai rapidamente preencher o seu tubo. Tenha em atenção que o volume no vaso de quimiostato mudou. Se várias amostras consecutivas são tomadas pode ser necessário para reduzir o fluxo para manter uma taxa de diluição constante. </li></ol> 7. Aplicação 2: Medição precisa das diferenças de taxas de crescimento entre os genótipos em ambientes controlados usando ensaios de competição baseados em citometria de fluxo <ol><li> Quimióstatos pode ser utilizado para quantificar com precisão o efeito da concentração de nutrientessobre as diferenças nas taxas de crescimento (ou seja, de aptidão) entre diferentes origens genéticas. Por estirpes de co-cultura marcados com diferentes proteínas fluorescentes a taxa de alteração na abundância relativa durante o crescimento exponencial é determinada. A realização deste ensaio, em diferentes taxas de diluição (D) permite o estudo dos efeitos de concentração de nutrientes (s) sobre as diferenças de aptidão. </li><li> Estabelecer culturas de estado estacionário das duas linhagens nos vasos quimiostato separadas com taxas de diluição idênticos e um volume de 300 ml. </li><li> Passivamente amostra 1 ml de cada navio. Gire as células, ressuspender em tampão fosfato (PBS) e colocar a 4 ° C. Estas amostras contêm amostras de células homogêneas, que são controles para a análise de citometria de fluxo subseqüente. </li><li> Coloque o tubo de efluentes de um navio em um cilindro graduado autoclavado. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurre para baixo para expelir as células do chemostat. Quandoo volume atinge 150 ml, devolver o metal final do tubo efluente para a sua posição original (300 ml). Repetir com o segundo vaso, utilizando uma proveta graduada diferente. </li><li> Use etanol a 70% para manter a esterilidade durante a remoção do parafuso na parte superior do vaso de quimiostato. Coloque funil na abertura e despejar 150 ml de outra cultura no vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso. Repetir com o segundo vaso, usando o segundo funil. Cada vaso quimiostato agora contém uma mistura das duas estirpes. </li><li> Obter uma amostra de 1 ml de cada navio utilizando amostragem passiva cada 2-6 horas. Gire as células, ressuspender em PBS e armazenar a 4 ° C. Continue a tomar amostras para a gravação de 2-3 dias com cuidado o tempo que cada amostra foi colhida. </li><li> No fim do experimento, sonicado e diluir as amostras a ~ 2 x 10 6 células / ml. Utilizando citometria de fluxo, medir a proporção das duas estirpes em cada amostra. Como ambas as tensões estão crescendo exponencialmente, a diferença da taxa de crescimento relativo édeterminada por regressão linear de ln (strain1/strain2) contra o tempo (medido em gerações). O declive da regressão é proporcional à diferença na taxa de crescimento (isto é, a vantagem de fitness) de uma estirpe em relação à outra. </li><li> Como a cultura mista pode levar algum tempo para atingir um novo estado de equilíbrio, momentos precoce pode caber mal à regressão. Esta questão é melhor resolvido, permitindo 2-3 gerações a decorrer antes de iniciar a amostragem ou removendo pontos iniciais, que são valores atípicos claras. Por outro lado, uma vez que uma cepa tem suplantado o outro os dados não são mais úteis e esses pontos devem ser excluídos. </li></ol> 8. Aplicação 3: Evolução Experimental <ol><li> Evolução Experimental realizado em quimiostatos seleciona para mutantes que são aumentados em fitness no ambiente limitado em nutrientes. Seleção geralmente é realizada ao longo de centenas de gerações. </li><li> Estabelecer uma cultura chemostat estado estacionário utilizando uma cepagenótipo do conhecido (e seqüência do genoma de preferência conhecida) e um nutriente-limitação definida. </li><li> Para manter um &quot;registro fóssil&quot; da população adaptação passiva provar chemostat cada 2-3 dias e armazenar a amostra em 15% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Monitorar o reservatório mídia e reabastecer com meios frescos, se necessário. </li><li> Manter a cultura exponencialmente crescente de várias centenas de gerações. </li><li> Após a conclusão da placa de selecção de uma amostra de células em placas de agar sólido. Após as células se transformaram em colônias, pegar uma amostra imparcial de colônias usando palitos de dente e inocular clones em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo 100 ml de mídia. Permitir amostras clonais para crescer durante a noite, adicionar 100 ml de 30% de glicerol e armazenar em -80 ° C. </li><li> Caracterizar clones por seqüenciamento do genoma inteiro e realizando ensaios fenotípicos, incluindo a avaliação de aptidão física, utilizando uma estirpe de referência comum fluorescente etiquetado, conforme descrito na Aplicação 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Quimióstatos permitir o cultivo dos microrganismos em condições de estado estacionário de crescimento controlado. As células crescem continuamente a uma velocidade constante, resultando em um ambiente externo invariante. Isto está em contraste com os métodos de cultura em lotes em que o ambiente externo está em constante mudança e a taxa de crescimento das células é determinado pela interacção complexa de ambiente e genótipo. Assim, uma importante vantagem da cultura de micróbios em quimióstatos mais cul...

O crescimento das células é regulada por redes complexas de interagir factores genéticos e ambientais 1,2. O regulamento multifatorial do crescimento celular exige uma abordagem em nível de sistema para seu estudo. No entanto, o estudo rigoroso do crescimento celular regulamentada é desafiado pela dificuldade de controlar experimentalmente a velocidade com que as células crescem. Além disso, até mesmo nas experiências mais simples condições extracelulares são freqüentemente dinâmico e complexo como as células alteram continuamente o seu ambiente à medida que proliferam. Uma solução para estes problemas é fornecido pelo quimiostato: um método de cultura de células que permite o controlo das taxas de crescimento experimental de células em ambientes definidos, invariante e controladas. O método de cultura contínua usando um quimiostato foi descrito de forma independente por Monod 3 e Novick &amp; Szilard 4 em 1950. Como originalmente concebida, as células são cultivadas em um volume fixo de mídia que é connuamente diluída pela adição de novas mídias e remoção simultânea de mídias antigas e células (Figura 1). Acoplado equações diferenciais ordinárias (Figura 2) descrevem a taxa de variação da densidade de células (x) e a concentração de um nutriente limitante do crescimento (s) no recipiente de quimiostato. Importante, este sistema de equações prevê uma única (não-zero) estável no estado estacionário (Figura 3), com a implicação notável que, no estado estacionário, a taxa de crescimento específico das células (ou seja, a constante da taxa de crescimento exponencial) é igual à taxa em que a cultura é diluída (D). Através da variação da taxa de diluição é possível estabelecer populações de estado estacionário de células em diferentes taxas de crescimento e sob diferentes condições de limitação de nutrientes. O controle experimental da taxa de crescimento usando quimiostatos foi fundamental para o desenvolvimento de uma compreensão de como as mudanças fisiologia celularcom taxas de crescimento de 5,6. No entanto, este antigo pilar de métodos microbiológicos tornou-se cada vez mais obscuro durante a explosão na investigação em biologia molecular, durante o final do século XX. Hoje, renovou o interesse no controlo do crescimento de ambos os micróbios e organismos multicelulares e o advento de métodos genoma escala para análise de sistemas de nível renovou motivação para a utilização de quimióstatos. Aqui, descrevemos três aplicações que capitalizar sobre o controle preciso das taxas de crescimento das células e para o ambiente externo que são exclusivamente possível usando quimiostatos. Em primeiro lugar, descreve-se o uso de quimióstatos para investigar a forma como a abundância de milhares de biomoléculas - como transcritos e metabolitos - são coordenadamente regulada com a taxa de crescimento. Em segundo lugar, nós descrevemos como quimiostatos pode ser usada para obter estimativas precisas das diferenças de taxas de crescimento entre os diferentes genótipos em ambientes com limitação de nutrientes, utilizando experimentos de competição. Em terceiro lugar, nós descrevemos como quimiostatos podeser usado para estudar evolução adaptativa de células que crescem em ambientes pobres em nutrientes constantes. Estes exemplos exemplificar as formas em que quimiostatos estão permitindo investigações em sistemas de nível de regulação do crescimento celular, gênica por interações ambientais e evolução adaptativa.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td>
			<td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle 9.5 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-887-1</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinchcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-867</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper, Size 12, Green Neoprene</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-62991-42</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30703-02</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose ties 4 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9557052</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone Rubber</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>B000FMWTDE</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 3/8 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 7/32 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1E</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K164</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K161</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook Connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-66-18Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratchet Clamp</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06403-11</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Female</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45512-34</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Male</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45513-04</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MTGR05010</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9131037</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Air</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32047-77</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Nitrogen</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32048-63</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Proportioner Multitube Frames</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-50</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator, Two-Stage Analytical</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12-N145D580</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Adaptor, Stainless Steel</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y99-26450</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Male Adaptor</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>WES544</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norprene Tubing</td>
			<td>US Plastics</td>
			<td>57280</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod Base</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-58</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Cartridges</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03217-92</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboy 10 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-963-2A</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP-T10-RE</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-800-100</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride&middot;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424205000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423400010</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate&middot;5H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209198</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60400</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferric chloride&middot;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>I88-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate&middot;H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium molybdate&middot;2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC24330-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>folic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inositol (aka myo-inositol)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC12226-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niacin (aka nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-aminobenzoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC14621-2500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9755</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>riboflavin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4500-25G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP892-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0155-08-5</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of chemostats in microbial systems biology

Células regular sua taxa de crescimento em resposta a sinais do mundo externo. À medida que a célula cresça, diversos processos celulares deve ser coordenado, incluindo a síntese de macromoléculas, o metabolismo e, em última instância, o compromisso com o ciclo de divisão celular. O quimiostato, um método de controlar a taxa de crescimento experimental de células, proporciona um meio poderoso de estudar sistematicamente como os impactos a taxa de crescimento de processos celulares, incluindo a expressão de genes - e metabolismo - e as redes reguladoras que controlam a taxa de crescimento celular. Quando mantido por centenas de gerações quimióstatos podem ser usadas para estudar a evolução adaptativa de micróbios em condições ambientais que limitam o crescimento das células. Descreve-se o princípio de cultivos contínuos, demonstrar seu funcionamento e dar exemplos de suas diversas aplicações. Após um período de desuso após a sua introdução em meados do século XX, a convergência das metodologias genoma escala com uma renovada emteresse na regulação do crescimento celular e as bases moleculares da evolução adaptativa está estimulando um renascimento no uso de quimiostatos na pesquisa biológica.

Uma grande vantagem do quimióstatos é a capacidade de controlar a taxa de crescimento das células experimentalmente ao variar a taxa de diluição. Na brotação levedura, Saccharomyces cerevisiae, a morfologia de uma célula é informativo da fase do ciclo de divisão celular. As populações com taxas de crescimento superiores contêm uma maior proporção de células em divisão activa tal como determinado através da medição da fracção de células não gemuladas (Figura 5A). Análises de expr...

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The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.5K visualizações.  New York University.  Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular. 

Vídeo: The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Investigando a comunidade microbiana no intestino grosso da térmita - Entrevista

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Biologia

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Comunidades microbianas na Natureza e Laboratório - Entrevista

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologia de comunidades microbianas - Entrevista

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Usando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desenvolver ferramentas de diagnóstico

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life activities. Its high prevalence in general population and the severe limitations it causes, point out the necessity to find new efficient strategies to treat it. Together with the cognitive-behavioral treatments, relaxation represents a useful approach for the treatment of GAD, but it has the limitation that it is hard to be learned. The INTREPID project is aimed to implement a new instrument to treat anxiety-related disorders and to test its clinical efficacy in reducing anxiety-related symptoms. The innovation of this approach is the combination of virtual reality and biofeedback, so that the first one is directly modified by the output of the second one. In this way, the patient is made aware of his or her reactions through the modification of some features of the VR environment in real time. Using mental exercises the patient learns to control these physiological parameters and using the feedback provided by the virtual environment is able to gauge his or her success. The supplemental use of portable devices, such as PDA or smart-phones, allows the patient to perform at home, individually and autonomously, the same exercises experienced in therapist's office. The goal is to anchor the learned protocol in a real life context, so enhancing the patients' ability to deal with their symptoms. The expected result is a better and faster learning of relaxation techniques, and thus an increased effectiveness of the treatment if compared with traditional clinical protocols.

The Project on Virtual Reality Intelligent Multi-sensor System for the Treatment of Anxiety-related Disorders (INTREPID) is aimed at developing a multi-sensor context-aware virtual reality system for the treatment of anxiety-related disorders.

O uso de Biofeedback na Clínica de Realidade Virtual: O Projeto INTREPID

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in the environment, as well as directly for the transmission of pathogens to drinking water supplies. Natural porous media is composed of an intricate physical topology, varied surface chemistries, dynamic gradients of nutrients and electron acceptors, and a patchy distribution of microbes. These features vary substantially over a length scale of microns, making the results of macro-scale investigations of microbial transport difficult to interpret, and the validation of mechanistic models challenging. Here we demonstrate how simple microfluidic devices can be used to visualize microbial interactions with micro-structured habitats, to identify key processes influencing the observed phenomena, and to systematically validate predictive models. Simple, easy-to-use flow cells were constructed out of the transparent, biocompatible and oxygen-permeable material poly(dimethyl siloxane). Standard methods of photolithography were used to make micro-structured masters, and replica molding was used to cast micro-structured flow cells from the masters. The physical design of the flow cell chamber is adaptable to the experimental requirements: microchannels can vary from simple linear connections to complex topologies with feature sizes as small as 2 &mu;m. Our modular EcoChip flow cell array features dozens of identical chambers and flow control by a gravity-driven flow module. We demonstrate that through use of EcoChip devices, physical structures and pressure heads can be held constant or varied systematically while the influence of surface chemistry, fluid properties, or the characteristics of the microbial population is investigated. Through transport experiments using a non-pathogenic, green fluorescent protein-expressing Vibrio bacterial strain, we illustrate the importance of habitat structure, flow conditions, and inoculums size on fundamental transport phenomena, and with real-time particle-scale observations, demonstrate that microfluidics offer a compelling view of a hidden world.

Microfluidic devices can be used to visualize complex natural processes in real time and at the appropriate physical scales. We have developed a simple microfluidic device that mimics key features of natural porous media for studying growth and transport of bacteria in the subsurface.

Janela em um Microworld: Simple sistemas microfluídicos para estudar o transporte microbiana em Meios Porosos

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinar a contribuição dos Sistemas de energia durante o exercício

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

Ligando o risco de predação, Stress herbívoro fisiológica e decomposição da maca Usina

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...