SDC, ACH, e CJ foram apoiados por Começando Grants (ERC-STG-2012-309509), através do Conselho Europeu de Investigação. J.-MN foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) (2011-0018198) da Coreia; e do Programa Centro de Pesquisa Pioneer (2012-009586) através do NRF da Coréia financiado pelo Ministério da Ciência, TIC, e Planejamento Futuro (MSIP). Este trabalho também foi apoiado pelo Centro de Saúde BioNano-Guard financiado pela MSIP da Coréia como o Projeto Frontier Global (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL e J.-HH foram apoiados pelo Programa de Ciência da cidade de Seul, Coréia do Fellowship Seul. A proteína Rep rotulado foi uma generosa oferta do Dr. Suá Myong.

1. Deslize Preparação e Limpeza Uma câmara de microfluidos é composta por uma lâmina de quartzo e uma lamela. No tipo de prisma de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF), a superfície da lâmina de quartzo é fotografada. Portanto, é importante limpar uma lâmina de quartzo, cuidadosamente, com H 2 O, acetona, KOH, e soluções piranha. Th é de limpeza de multi-passo elimina moléculas orgânicas fluorescentes sobre uma superfície, que interferem com as medições de fluorescência de moléculas isoladas. Além disso, a gravura piranha torna a superfície hidrófila de quartzo através da geração de grupos hidroxilo. Os grupos hidroxilo livres são essenciais para a reacção de amino-silanização no Passo 3. <ol><li> Lâminas de perfuração de quartzo. Faça um par de buracos em um slide de quartzo com um bit 3/4 mm de perfuração de diamante (Figura 2a). Se vários canais são desejados, perfurar mais pairs dos orifícios (Figura 2b). Estes orifícios são usados ​​para a injecção de soluções para uma câmara de microfluidos no Passo 7. <ol><li> Manter a broca molhado em H2O durante a perfuração. H 2 O funciona como um lubrificante, o que aumenta o tempo de vida da broca. </li><li> Ocasionais limpando a ponta da broca ajuda a abertura de furos. </li><li> Após a abertura de furos, marque um lado da lâmina para facilitar a identificação durante o processo PEGylation. Os marcadores podem ser utilizados como referência, para evitar confusão mais tarde. Para a marcação, uma broca de diamante pode ser usado. Não utilize qualquer caneta desde que a tinta pode ficar na superfície. </li></ol></li><li> Limpeza com H 2 O. Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração. Tipicamente, de 5 a 15 as lâminas podem ser colocadas num recipiente. Lavar as lâminas com MilliQ H 2 O. Repita 3 vezes e sonicate os slides com MilliQ H2O por 5 min para remover a sujeira. Descarte a água e lave os slides de novo 3 vezes comMilliQ H 2 O. Note-se que 130 W é a energia de ultra-sons utilizado para este protocolo. Poder sonicação Superior pode diminuir a vida útil das lâminas de quartzo. </li><li> A limpeza com acetona. Substitua o MilliQ H2O com acetona. Sonicar as lâminas com acetona durante 20 minutos ou mais. </li><li> A lavagem com H 2 O. Descarte a acetona e enxaguar as lâminas com MilliQ H 2 O. Repita isso por três vezes, a fim de remover qualquer resíduo de acetona. </li><li> Limpeza com KOH. Substitua a água com 1 M KOH e sonicate os slides para 20 minutos ou mais. Corrosão excessiva (por exemplo, tratamento KOH overnight) irá melhorar a qualidade da superfície, mas vai apresentar arranhões, o que pode interferir com imagens de fluorescência. </li><li> A lavagem com H 2 O. Lavar as lâminas com MilliQ H2O por 3 vezes para remover vestígios de KOH. </li><li> Gravura Piranha. <ol><li> Transferir as lâminas para um suporte de slides Duran ou um titular de Teflon feito por encomenda e place-los num copo (1 L), que está localizada numa chaminé de química. </li><li> Encher o recipiente com 450 ml de H 2 SO 4. </li><li> Adicionar 150 ml de H 2 O 2 para relação de 3:1 entre H 2 SO 4 e H 2 O 2. Uma vez que a solução começa a ferver espontaneamente, a temperatura aumenta acima de 90 ° C. Certifique-se de que a solução de H 2 O 2 está à temperatura ambiente antes de iniciar a reacção. Caso contrário, a temperatura de ebulição da solução pode ser inferior a 90 ° C. </li><li> Agita-se a solução para uma mistura apropriada e permitir que o recipiente em repouso por 20 minutos. </li><li> Tome as lâminas da solução piranha, juntamente com o titular do slide, e colocá-los no porta-lâminas contendo MilliQ H 2 O. Enquanto isso, descartar a solução piranha em um frasco de resíduos designada uma vez que atinge a temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas três vezes com H 2 O. MilliQ Cuidado extra deve ser tomado em mais steps para evitar qualquer possível contaminação de slides. Continue na Etapa 3. Aconselha-se a proceder de imediato com os seguintes passos. * Atenção: A solução piranha é extremamente reativo. Ao manusear esta solução cuidado extra deve ser tomado. Além disso, quando por engano misturados com solventes orgânicos, tais como acetona, que pode provocar uma explosão. </li></ol></li></ol> 2. Limpeza Coverslip Uma câmara de microfluidos é composta por uma lâmina de quartzo e um lábio de cobertura s. Quando um TIRF microscópio do tipo prisma é utilizada, a superfície de uma lamela não é visualizada. Portanto, é suficiente para limpar uma lamela apenas com H 2 O e KOH. No caso de uma lamela deve ser trabalhada (por exemplo, através da microscopia TIRF tipo objectivo), recomenda-se a tratar as lamelas com solução piranha (Passo 1.7). Note que se PEGylation da superfície da lamela não é de alta qualidade, ele pode atuar como um dissipador de proteínas umad dar origem a variações na concentração de proteína. <ol><li> A lavagem com H 2 O. Colocar lamelas (24 x 30, 24 x 40, ou 24 x 50 mm 2) em um frasco de vidro para coloração. Tipicamente, de 5 a 15 lamelas podem ser colocados num único frasco. Lavar as lamelas 3 vezes com o MilliQ H 2 O. </li><li> Limpeza com KOH. Substitua a água com KOH 1M e sonicate as lamelas de 20 min ou mais. </li><li> A lavagem com H 2 O. Lavar as lamelas 3 vezes com MilliQ H 2 O para remover os vestígios de KOH. Continue na Etapa 3. </li></ol> 3. Amino-silanização de Slides e Lamelas Funcionalização da superfície das lâminas de quartzo e as lamelas com o grupo amina por meio da química amino-silanização. O metanol é usado como solvente e ácido acético como catalisador para a reacção de amino-silanização. <ol><li> A lavagem com metanol. Substitua o MilliQ H2O nos pratos de coloração (a partir de SPTE 1 e 2) com metanol. Mantenha os slides e as lamelas em metanol até Passo 3.3. Não armazenar as lâminas e as lamelas em metanol durante um tempo desnecessariamente longo período de tempo (por exemplo, várias horas) desde que as impurezas em metanol irá adsorver à superfície. </li><li> Preparar solução de amino-silanização. <ol><li> Lavar um balão de pirex várias vezes com metanol. Sonicar o frasco com metanol durante 5 minutos ou mais. É aconselhável ter um frasco dedicado que é mantido limpo. </li><li> Verter 100 mL de metanol, para o balão. </li><li> Adicionar 5 ml de ácido acético. </li><li> Adicionar 3 ml de APTES (3-aminopropil trimetoxissilano) e misture delicadamente por sacudi-la. </li></ol></li><li> Amino-silanização. Substituir o metanol nos pratos de coloração que contêm as lâminas e as lamelas de cobertura com a mistura de reacção aminosilanization. <ol><li> Incubar por 20-30 min. Durante a incubação, sonicar uma vez durante 1 min. </li></ol></li><li> A lavagem com metanol. Substitua a umminosilanization reacção com metanol. Descartar o metanol e adicionar uma solução de metanol fresco. Repita este procedimento três vezes. </li></ol> 4. Passivation superfície usando Polymer (A Primeira Rodada) Passivação da superfície revestida de amina de lâminas e lamelas de quartzo através da conjugação de NHS-éster de polietileno glicol (PEG). Esta reacção é levada a cabo com a concentração de saturação da solução de PEG a um pH de 8,5 durante a noite. <ol><li> Secagem lâminas e lamínulas. Secam-se as lâminas e as lamelas utilizando gás N2 e colocá-los em caixas de pipetas limpo, de tal maneira que o lado que não tem de ser tratado com PEG está virada para cima. A caixa de pipeta é parcialmente preenchido com MilliQ H 2 O. Esse ambiente úmido impede solução PEGylation sequem durante a incubação durante a noite. </li><li> Preparar tampão de reacção. Prepare a 0,1 M de tampão de fresco de bicarbonato de sódio (pH 8,5) por dissolução de 84 mg de bicarbonato de sódio em 10 ml deMilliQ H 2 O. Não há necessidade de ajustar o pH. Esta solução pode ser armazenado congelado para a próxima utilização (por exemplo, Passo 6.1). </li><li> Preparar solução PEGylation. <ol><li> Prepara-se uma mistura de PEG de 0,2 mg biotiniladas NHS-éster de PEG (5000 Da) e 13 8 mg de NHS-éster de mPEG (5000 Da), em um tubo de 1,5 ml. Quando se prepara o número N de lâminas, preparar N vezes maior quantidade da mistura de PEG num único tubo. </li><li> Adicionar 64 mL (ou N vezes 64 mL de N número de lâminas) do buffer recém-preparado (Passo 4.2). Pipetar para cima e para baixo a fim de dissolvê-los completamente. </li><li> Centrifugar com 16.100 xg por 1 min para remover as bolhas de ar. Não pipete depois. De outro modo, as bolhas de ar se formam, que interferem com a PEGilação no passo 4.4. </li></ol></li><li> PEGylation. <ol><li> Queda de 70 uL da mistura de PEGilação para uma lâmina de quartzo seca do Passo 4.1. Utilizar 90 mL, no caso de 24 x 50 mm 2 coverslip. </li><li> Delicadamente, coloque uma lamela seco a partir do Passo 4.1 sobre a solução. </li><li> Para se ter uma alta qualidade uniforme e de PEGylation, tome cuidado para não introduzir bolhas de ar. Devido à tensão de superfície, a maior parte das bolhas de ar podem sair espontaneamente o volume de reacção dentro de cinco minutos, devido à tensão superficial. </li><li> Incubar as lâminas em um ambiente escuro e úmido. A meia-vida de NHS-éster de PEG que usamos a pH 8 é de cerca de uma hora. No mínimo, a incubar durante 2 horas. Incubação durante a noite conduz a uma maior qualidade de PEGilação (dados não mostrados). </li></ol></li></ol> 5. Armazenamento de longo prazo Armazenar as lâminas e lamínulas em N 2 PEGilados a -20 º C. <ol><li> Secagem lâminas e lamínulas. Desmontar cuidadosamente a lâmina ea lamínula, deslizando a lamela para um lado, lavá-los com MilliQ H 2 O, e seque-as com N 2. </li><li> Armazenar lâminas e lamínulas. For uso imediato, siga o procedimento para a segunda rodada de PEGylation (Passo 6). Para armazenar por um longo período de tempo, siga os seguintes passos. <ol><li> Coloque um par de lâmina e lamela em um tubo de 50 ml de tal forma que as superfícies estão PEGilados virada para fora um do outro. </li><li> Parcialmente fechar o tubo, o tubo de vácuo, em seguida, preenchê-lo com N 2. Estes passos ajudar a preservação da superfície PEGuilado por um longo período de tempo. Aperte o tubo bem e armazená-lo a -20 ° C. A qualidade das lâminas permanece bom por até 3 meses (Figura 3A, à direita). </li></ol></li></ol> 6. Passivation superfície usando Polymer (o segundo turno) Ronda adicional de PEGilação para tornar a camada mais densa de PEG e também para matar todos os restantes grupos amina sobre a superfície. O uso de moléculas de PEG de NHS de éster de curta duração (333 Da) pode ser eficaz no que penetra uma camada de PEG existente. É recommended fazer esta segunda rodada de PEGylation direita antes de usar um slide. <ol><li> Preparar tampão de reacção. Prepare a 0,1 M de tampão de bicarbonato de sódio fresco (pH 8,5). A solução congelada a partir do Passo 4.2, também podem ser usados. </li><li> Preparar solução PEGylation. Dissolve-se 7 ul de 250 mM MS4-PEG em 63 ul de tampão bicarbonato de sódio a. </li><li> PEGylation. Seguem o mesmo procedimento como no passo 4.4. Incubar por 30 min até durante a noite. </li><li> Secagem lâminas e lamínulas. Desmonte a par da lâmina ea lamínula, lavá-los com MilliQ H 2 O, seque-os com N 2, e mantê-los em uma caixa de pipeta limpa. Prossiga para a montagem de uma câmara microfluídicos no Passo 7. </li></ol> 7. Montar uma Câmara Microfluidic Montar uma câmara microfluídicos usando um par de um quartzo de slides peguilado e uma lamela. Fita adesiva dupla face é usado como um espaçador. A câmara é selada com cola epóxi e, assimluções são introduzidos através dos orifícios da corrediça de quartzo. <ol><li> Coloque uma lâmina de quartzo sobre uma superfície plana com a face voltada para cima da PEGuilado. </li><li> Fazer um canal (largura 5-7 mm) na diagonal na superfície de PEGuilado colocando fitas adesivas de dupla face sobre a lâmina. Certifique-se de que os orifícios estão posicionados no centro do canal. Tome cuidado para não estragar a superfície da PEGylated durante o processo de fabricação de uma câmara. É possível fazer um slide de multi-canal, colocando e aderindo as fitas adesivas de dupla face de forma diferente (ver Figura 2). </li><li> Delicadamente, coloque uma lamela PEGylated em cima para completar a câmara. O lado PEGylated deve estar voltado para baixo. </li><li> Selar a câmara pressionando a lamela sobre a área onde as fitas dupla face são colocados. Fazê-lo suavemente, mas cuidadosamente para que a câmara se torna água hermeticamente fechado. </li><li> Fechar as extremidades da câmara de cola epóxi. </li><li> Imobilizar estreptavidina ou neutravidina nabiotinilado camada de PEG pela adição de 50 ul de 0,1 mg / ml de solução de estreptavidina ou neutravidina em T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], tampão de NaCl 50 mM) usando uma pipeta de p200. Após 1 min de incubação, lavar com 100 mL de tampão T50. </li><li> Adicionar moléculas biológicas biotinilados para sua única molécula de imagem. </li></ol> 8. Deslize Reciclagem Reciclagem de lâminas de quartzo. Slides utilizados são reciclados por tirar as lamelas e as fitas adesivas de dupla face. <ol><li> Após o uso, guarde as câmaras na água da torneira. Incubação longo prazo na água facilita a desmontagem das câmaras. </li><li> Ferva as câmaras na água da torneira usando um microondas. Use uma proveta de Pyrex. Ferva por 10 minutos ou mais. </li><li> Tire as lamelas e as fitas adesivas de dupla face, usando uma lâmina de barbear. Não pressione um slide quartzo perpendicular ao seu plano. Caso contrário, ele quebra. Manter a lâmina de barbear para longe do canal. Otherwise, introduz riscos no canal. </li><li> Lavar as lâminas usando um detergente doméstico, esfregando-os com os dedos. </li><li> Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração. Tipicamente, de 5 a 15 as lâminas podem ser colocadas num recipiente. Adicionar 10% de detergente doméstico e sonicate os slides para 20 minutos ou mais. Lavar as lâminas com uma grande quantidade de água da torneira. </li><li> Vá para o Passo 1.2. </li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

As etapas críticas dentro deste protocolo É essencial para fazer a superfície hidrófila antes da reação amino-silanização. Isto foi conseguido através da gravura piranha que gera os grupos hidroxilo livres em uma superfície de vidro / quartzo. Recomenda-se não para manter a superfície atacada piranha expostas quer a H2O ou a ar durante um longo período de tempo desde que a hidrofilicidade da superfície diminui gradualmente. As moléculas de éster de NHS-PEG são reactivos. Aconselha-se a fazer alíquotas e armazená-los sob azoto, em -20 º C. O prazo de validade do produto químico APTES na temperatura ambiente é curto. Aconselha-se a substituí-lo por um novo a cada mês. Modificações deste protocolo Quando você não pode usar a gravura piranha por qualquer motivo prático, você pode gravar usando KOH por um longo período de tempo (por exemplo, overnight), o que também vai fazer grupos hidroxilo expostos. A armadilha de esta abordagem alternativa é a de que a lâmina torna-se inutilizável depois de algumas reciclagens devido a arranhões severos. Ele é muitas vezes praticada para queimar uma superfície de vidro / quartzo usando maçarico a gás, o qual é eficaz na eliminação de materiais orgânicos fluorescentes 7. Este procedimento não foi incluído neste protocolo, pois é redundante para o condicionamento piranha. Note-se que este procedimento irá potencialmente conduzir a oxidação dos grupos hidroxilo. Portanto, este procedimento não deve ser realizado uma vez por superfície foi gravado usando KOH ou solução piranha. Quando um tampão com pH inferior a 7 é usado para uma única molécula de imagem, a conformação de PEG muda de &quot;cogumelos&quot; a &quot;escova&quot;, o que reduz o grau de passivação. Portanto, quando o pH inferior a 7,0 é usado, é recomendável para passivar a superfície posterior utilizando tartarato de dissuccinimidilo &lt;sup&gt; 7. Perspectivas Este trabalho tem proporcionado um protocolo robusto para atingir alta qualidade de superfície de passivação. Este protocolo irá ser útil para estudos de fluorescência de moléculas individuais que estão envolvidos com as proteínas de 14, bem como complexos de proteína dentro de extractos de células e imunoprecipitados 15. Será amplamente utilizado para outras técnicas de molécula única, como a espectroscopia de força e espectroscopia de binário 16. Será também útil para prevenir a adsorção de células a partir de uma superfície 17. O protocolo fornecido neste trabalho é exigente para os seus procedimentos de várias etapas. Passivação superficial utilizando lípido PEG-8 e de poli-lisina PEG 9 estão disponíveis como uma abordagem alternativa. Desde então, eles não precisam de qualquer reação química é fácil de implementar. No entanto, o grau de passivação não é tão elevada como a conseguida através modif químicacação de uma superfície.

Ao efectuar um estudo de uma única molécula de proteína que é essencial para atingir uma elevada qualidade de passivação da superfície, de modo que a experiência é livre de qualquer mau funcionamento da proteína induzida à superfície ou a desnaturação de 1,2. Embora uma superfície de vidro tratado com surfactantes, tais como albumina do soro bovino, é vulgarmente utilizado para os estudos de ácido nucleico única molécula de 3, o seu grau de passivação não é suficientemente elevada para os estudos de proteína. A superfície de vidro revestido com polímero (polietilenoglicol, PEG) é superior no desempenho 4-6 passivação. Desse modo, tornou-se universalmente utilizado para estudos de proteína única molécula desde que foi apresentado a um estudo de fluorescência única molécula 7-10. O processo de revestimento de polímero requer vários tratamentos de superfície 7,11,12. Portanto, é difícil para acompanhar todo o processo sem instruções detalhadas. Muitas vezes, o grau de passivação da superfície varia de acordo com o protocolo is seguidas. Aqui apresentamos um protocolo robusto, com instruções passo-a-passo, que irá remover um dos principais gargalos de estudos de proteína única molécula. Veja a Figura 1 para uma descrição.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Slide preparation and cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0136 631-0144 631-0147</td>
			<td>24x32mm2, 22x40mm2, 
			24x50mm2 &#160;(No.1&#189;, 
			Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bits</td>
			<td>MTN-Giethoorn, The Netherlands</td>
			<td>LA-0564-00DB</td>
			<td>3/4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass staining dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>300101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Boom</td>
			<td>6233905</td>
			<td>Opened bottles should be stored at 4 &#176;C. 
			1 L, hydrogen peroxide 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Boom</td>
			<td>80900627.9010</td>
			<td>Sulfuric acid 95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz slides</td>
			<td>Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td>1&#8221; x 3&#8221;, 1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2. Coverslip cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3. Amino-silanization of slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099-500ML</td>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td>Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 
			3-aminopropyl trimethoxysilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (200mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Flask (200 mL)</td>
			<td>Have one flask dedicated for aminosilanization. 
			Pyrex flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4. Surface passivation using polymer (the first round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td>Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&#160;Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6. Surface passivation (the second round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DST</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20589</td>
			<td>Disuccinimidyl tartarate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS4-PEG</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>22341</td>
			<td>Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 &#176;C. 
			Short NHS-ester PEG, MW 333 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7. Assembling a microfluidic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sticky tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>10mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>G14250</td>
			<td>Devcon 5 minute epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1 KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td>Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 &#176;C. 
			ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-888</td>
			<td>Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1 KG</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface passivation for single-molecule protein studies

Espectroscopia de fluorescência de moléculas individuais provou ser fundamental para a compreensão de uma ampla gama de fenômenos biológicos em nanoescala. Exemplos importantes do que esta técnica pode render às ciências biológicas são as idéias mecanicistas sobre proteína proteína e proteína-interações ácido nucleico. Quando as interacções de proteínas são sondadas no nível de uma única molécula, as proteínas ou os seus substratos são frequentemente imobilizado sobre uma superfície de vidro, o que permite uma observação a longo prazo. Este esquema de imobilização pode introduzir artefatos superficiais indesejáveis. Portanto, é essencial para passivar a superfície do vidro para tornar inerte. Revestimento de superfícies utilizando polietileno glicol (PEG) destaca-se por sua alta performance na prevenção de proteínas de interagir não especificamente com uma superfície de vidro. No entanto, o procedimento de revestimento de polímero é difícil, devido a uma complicação que resulte de uma série de tratamentos de superfície e a exigência rigorosa que uma superfície precisaestar isento de quaisquer moléculas fluorescentes, no final do procedimento. Aqui, nós fornecemos um protocolo robusto, com instruções passo-a-passo. Abrange limpeza de superfícies, incluindo decapagem piranha, funcionalização de superfície com grupos amina e, finalmente, revestimento PEG. Para se obter uma elevada densidade de uma camada de PEG, que introduzem uma nova estratégia para o tratamento de superfície com moléculas de PEG em duas voltas, o que melhora notavelmente a qualidade de passivação. Nós fornecemos resultados representativos, bem como conselhos práticos para cada passo crítico para que qualquer pessoa pode alcançar a superfície passivation alta qualidade.

Após a montagem de câmara de microfluídica (Passo 7,1-7,6) e antes da realização de Passo 7.7, é aconselhável realizar o controle da superfície PEGylated qualidade. Se a passivação da superfície foi feita com sucesso, existem menos do que 10 não especificamente proteínas adsorvidas por área de imagem (25 mm x 25 mm) quando observada 1-10 nM de proteína marcada por fluorescência é adicionado para dentro da câmara (Figura 3a, à esquerda). Quando qualquer uma das etapas de limpeza ou de reação não foi devidamente realizado, o número de não especificamente adsorvido proteínas aumenta significativamente, ea tela do CCD pode ser saturada por sinais de fluorescência. Por exemplo, se o condicionamento piranha é ignorada, não é 100 vezes maior quantidade de adsorção não-específica observada (Figura 3a; comparar deixou com meio). Quando o segundo passo de PEGuilação é ignorada, houve cerca de 3 horasa maior quantidade de adsorção não-específica observada (Figura 3b). Um baixo grau de PEGilação é observada quando os produtos químicos no fim (por exemplo, APTES armazenado à temperatura ambiente durante vários meses) são utilizadas (dados não apresentados). A qualidade da superfície também cai quando uma quantidade significativa de tempo já passou por uma vez que foi PEGuilado (figura 3a, comparar esquerda com direita). Para o nosso melhor conhecimento, é a primeira vez que as duas rodadas de PEGylation são introduzidos para estudos de moléculas individuais. As duas rodadas de PEGylation garantir a mais alta qualidade de formação da camada PEG (Figura 3b). A natureza superior da dupla PEGylation está proeminentemente mostrado nos filmes (Compare 1a filme com 1b Filme). Nestes filmes, os sinais de fundo de moléculas fluorescentes em solução são observados para ser muito mais fraco do que o dobro PEGilação<html> utilizado, o que indica que as proteínas são repelidos mais eficazmente pela camada duplamente peguilado. Embora este processo de duas etapas é altamente recomendável, a segunda etapa PEGylation pode ser ignorada se a experiência é tolerável para passivação não ideal. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Esquemática dos tratamentos de superfície (a) uma lâmina de microscópio é limpa com acetona, KOH, e soluções piranha. Ele é funcionalizado com APTES e PEGuilado com NHS-éster de PEG. (B) Uma lamela são limpas com KOH, bem como com a solução piranha se necessário. Ele é funcionalizado com APTES e PEGuilado com NHS-éster de PEG. &quot;width =&quot; 500 fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Câmara microfluídicos (a) A câmara de canal único. A lâmina de microscópio tem dois furos. É montado com uma lamela usando duas fatias de uma fita adesiva dupla face. (B) Uma câmara de três canais. A lâmina de microscópio tem seis furos. É montado com uma lamela usando quatro fatias de uma fita adesiva dupla face. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: imagens CCD tiradas com as proteínas marcadas com corante em solução. (A) imagens CCD foram tiradas por microscopia de fluorescência total de reflexão interna do tipo prisma usando uma lente objetiva de 60X com 10 nM Cy3-labeld Rep em solução. (Esquerda) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo. (Média) A superfície foi prepaseguindo o protocolo neste artigo vermelho, mas piranha gravura foi ignorada. (Direita) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo e armazenados durante 3 meses a -20 ° C sob azoto. (B) imagens CCD tiradas com 10 nM Cy3-labeld Rep em solução. (Esquerda) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo. (Direita) A superfície foi preparada seguindo o protocolo neste artigo, mas a segunda rodada de PEGylation foi ignorada. Barra de escala = 5 um. Filme 1: filmes CCD tiradas com as proteínas marcadas com corante em solução. Filmes CCD foram tiradas por microscopia de fluorescência total de reflexão interna do tipo prisma usando uma lente objetiva de 60X com 10 nM Cy3-labeld Rep em solução. O tempo de resolução é de 100 ms. (A) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo. (B) A superfície foi preparada seguindo o protocolo neste artigo, mas a segunda rodada de PEGylção foi ignorada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">Clique aqui</a> para ver 1a filme e <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">clique aqui</a> para ver 1b Filme.

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Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Descreve-se um método para passivação de uma superfície de vidro, usando polietilenoglicol (PEG). Este protocolo abrange limpeza de superfícies, funcionalização de superfície e revestimento PEG. Nós introduzimos uma nova estratégia para o tratamento da superfície com moléculas de PEG mais de dois rounds, que produz qualidade superior de passivação em relação aos métodos existentes.

Passivação da superfície de Estudos de proteína única molécula

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

surface-passivation-for-single-molecule-protein-studies

Research

JoVE Journal

Chemistry

41.5K visualizações.  Delft University of Technology.  Descreve-se um método para passivação de uma superfície de vidro, usando polietilenoglicol (PEG). Este protocolo abrange limpeza de superfícies, funcionalização de superfície e revestimento PEG. Nós introduzimos uma nova estratégia para o tratamento da superfície com moléculas de PEG mais de dois rounds, que produz qualidade superior de passivação em relação aos métodos existentes. 

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Química

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

Transporte de nanotubos de carbono de superfície modificada através de uma coluna de solo

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

Um Método para Manipular a Tensão Superficial de um Metal Líquido via Oxidação e Redução Superficial

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single molecule level. An electrostatic self-assembly and covalent fixation (ESA-CF) process is used for the synthesis of the cyclic poly(tetrahydrofuran) (poly(THF)). The diffusive motion of individual cyclic polymer chains in a melt state is visualized using single molecule fluorescence imaging by incorporating a fluorophore unit in the cyclic chains. The diffusive motion of the chains is quantitatively characterized by means of a combination of mean-squared displacement (MSD) analysis and a cumulative distribution function (CDF) analysis. The cyclic polymer exhibits multiple-mode diffusion which is distinct from its linear counterpart. The results demonstrate that the diffusional heterogeneity of polymers that is often hidden behind ensemble averaging can be revealed by the efficient synthesis of the cyclic polymers using the ESA-CF process and the quantitative analysis of the diffusive motion at the single molecule level using the MSD and CDF analyses.

A protocol for the synthesis and characterization of diffusive motion of cyclic polymers at the single molecule level is presented.

Síntese de polímeros cíclicos e Caracterização do seu movimento difusivo no estado fundido na molécula de nível único

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Preparação de Íons Aziridínio Bicíclicos Estáveis e sua Abertura de Anel para a Síntese de Azaheterociclos

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. However, the main issue limiting their applicability is their poor stability in humid conditions. The common methods to overcome this problem involve the formation of strong metal-linker bonds by using highly charged metals, which is limited to a number of structures, the introduction of alkylic groups to the framework by post-synthetic modification (PSM) or chemical vapour deposition (CVD) to enhance overall hydrophobicity of the framework. These last two usually provoke a drastic reduction of the porosity of the material. These strategies do not permit to exploit the properties of the MOF already available and it is imperative to find new methods to enhance the stability of MOFs in water while keeping their properties intact. Herein, we report a novel method to enhance the water stability of MOF crystals featuring Cu2(O2C)4&#160;paddle-wheel units, such as HKUST (where HKUST stands for Hong Kong University of Science &#38; Technology), with the catechols functionalized with alkyl and fluoro-alkyl chains. By taking advantage of the unsaturated metal sites and the catalytic catecholase-like activity of CuII ions, we are able to create robust hydrophobic coatings through the oxidation and subsequent polymerization of the catechol units on the surface of the crystals under anaerobic and water-free conditions without disrupting the underlying structure of the framework. This approach not only affords the material with improved water stability but also provides control over the function of the protective coating, which enables the development of functional coatings for the adsorption and separations of volatile organic compounds. We are confident that this approach could also be extended to other unstable MOFs featuring open metal sites.

Robust functional catechol coatings were produced in one step by direct reaction of the material known as HKUST with synthetic catechols under anaerobic conditions. The formation of homogeneous coatings surrounding the entire crystal is ascribed to the biomimetic catalytic activity of Cu(II) dimers on the external surface of the crystals.

Functionalization superfície de estruturas Metal-orgânicas para resistência à umidade melhorada

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) with a 4.6 nm pore size, and ordered silica porous matrix, SBA-15, with a 5.3 nm pore size. This work describes the surface properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the differently ordered porous materials with similar pore sizes. For this purpose, OMC and SBA-15 with highly ordered nanoporous structures are synthesized via impregnation of the silica matrix by applying a carbon precursor and by the sol-gel method, respectively. The porous structure of investigated systems is characterized by an N2 adsorption-desorption analysis at 77 K. To determine the electrochemical character of the surface of synthesized materials, potentiometric titration measurements are conducted; the obtained results for OMC shows a significant pHpzc shift toward the higher values of pH, relative to SBA-15. This suggests that investigated OMC has surface properties related to oxygen-based functional groups. To describe the surface properties of the materials, the contact angles of liquids penetrating the studied porous beds are also determined. The capillary rise method has confirmed the increased wettability of the silica walls relative to the carbon walls and an influence of the pore roughness on the fluid/wall interactions, which is much more pronounced for silica than for carbon mesopores. We have also studied the melting behavior of D2O confined in OMC and SBA-15 by applying the dielectric method. The results show that the depression of the melting temperature of D2O in the pores of OMC is about 15 K higher relative to the depression of the melting temperature in SBA-15 pores with a comparable 5 nm size. This is caused by the influence of adsorbate/adsorbent interactions of the studied matrices.

Here we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon (with a 4.6 nm pore size) and SBA-15 (with a 5.3 nm pore size). The work describes the surface and textural properties of nanoporous molecular sieves, their wettability, and the melting behavior of D2O confined in the materials.

Propriedades de superfície de carbono de Nanoporous sintetizado e matrizes de sílica

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.