O financiamento para esta obra é fornecida pelo National Health and Medical Research Council da Austrália (NHMRC projeto de subsídio para 1.011.352 MEC e MJC; institutos de pesquisa independentes Regime de Apoio Infra-estrutura [IRIISS] subvenção para WEHI) e do Governo de Victoria (VESKI Inovação Fellowship ao MEC; vitoriana do Governo do Estado de Infra-estrutura de Apoio Operacional à WEHI). MEC é uma rainha Elizabeth II Fellow do Conselho de Pesquisa Australiano. EFXB reconhece o apoio do Programa de Bolsas de Norma Hilda Schuster, da Universidade de Melbourne.

1. Clonagem e Design Construct Clonar as sequências de interesse no vector PMM-peptídeo (que podem ser fornecidos a pedido), utilizando os locais de restrição HindIII e BamHI (ver Figura 1). O inserto de DNA de cadeia dupla deve incorporar, na seguinte ordem: um sítio HindIII, um único codão de metionina para a clivagem com CNBr, a E. peptídeo coli codões optimizados sequência codificadora, um codão de paragem, um sítio BamHI. Todas as outras metioninas no péptido devem ser eliminados e a sequência de dipeptídeo asp-pro deve ser evitada, uma vez que vai também ser clivado em condições ácidas. Um único resíduo de cisteína devem ser introduzidos em cada sequência de péptido de acordo com o posicionamento desejado da reticulação dissulfito no complexo final, e todas as outras cisteínas deve ser mutado para serina. O plasmídeo transporta uma cassete de resistência à canamicina para selecção. 2. Expressão de trpLE-peptiFusão de <ol><li> Faça-se e estéril filtro M9/Kan meio de crescimento mínima (0,1 mM CaCl 2, 2 mM de MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L de NaCl, 1 g / L de NH 4 Cl, 4 g de glicose / L, 50 mg / L de sulfato de canamicina). Suplemento com Centrum Completa A a zinco para fornecer vitaminas do complexo B e metais vestigiais:. Dissolver 1 comprimido em 40 ml de H2O com agitação durante 30 min, centrifugação para remover o material insolúvel e o sobrenadante filtro estéril laranja Solução estoque armazenamento a 4 ° C no escuro durante 2 semanas, e utilizar 4 ml / L em M9. NOTA: 15 N-NH 4 Cl enriquecido, 13 C-glucose enriquecida ou outros precursores estáveis, marcada com isótopos podem ser incluídos no meio M9, nesta fase, se desejado. </li><li> Inocular uma cultura de 100 ml de arranque a partir de recém-transformadas BL21 (DE3) estirpe E. coli em meio M9/Kan. Crescer durante a noite a 37 ° C com agitação a 200 rpm. </li><li> Na manhã seguinte, verificar a DO600 da cultura iniciadora - este deve estar na gama de 2 ou superior. Dilui-se a 100 ml da cultura de arranque em 1 l de volume total de Centrum suplementado meio M9. Dividido em dois frascos de 2 L confundidos (500 ml de cultura em cada frasco) e crescer a 37 ° C com agitação a 140 rpm até que a DO600 atinge 0,6. </li><li> Ajuste a temperatura agitador a 18 ° C e continuar a agitar durante 1 hora, permitindo que as culturas para refrigerar completamente antes da indução. </li><li> Tomar uma amostra de pré-indução por análise SDS-PAGE (equivalente a 50 ul de uma cultura de OD = 1 600), em seguida, adicionar IPTG para 0,1 mM de concentração final para induzir a expressão da fusão do peptídeo trpLE. Continuar a crescer a 18 ° C/140 rpm durante a noite (16-20 horas) sob indução IPTG. </li></ol> 3. Preparação inclusão Corpo e Encadernação matriz de níquel <ol><li> A DO final 600 de culturas de expressão durante a noite em meio mínimo é variável e should estar compreendida entre 2,5 e 5,0. Tomar uma amostra para análise de SDS-PAGE (equivalente a 50 ul de uma cultura de OD 600 = 1) e recolher as células por centrifugação durante 20 min a 5.000 x g. </li><li> Ressuspender o sedimento de células a partir de 1 L de cultura em 50 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). As suspensões de células podem ser armazenadas congeladas para posterior processamento. </li><li> Lisar as células por sonicação em gelo na saída máxima durante 1 min e repouso em gelo durante 5 min. Nós usamos um sonicador Misonix 3000 (saída máxima de 600 watts), com uma ponta de ½ polegada de alta intensidade substituível. Repita sonicação / arrefecimento por três ciclos. </li><li> Colete insolúvel de corpos de inclusão do material (IB) por centrifugação durante 15 min a 20000 xg e desprezar o sobrenadante. Uma camada, solto fino de cor clara de detritos celulares pode ser visível na parte superior do sedimento denso IB, o que pode ser lavado com água ou tampão com agitação suave. Passos 3.3 e 3.4 podem ser repetidas para melhorar a pureza da fracção de IB se desivermelho. As amostras de pellet e sobrenadante de material deve ser tomado para análise de SDS-PAGE para confirmar a localização trpLE-TM fusão de corpos de inclusão. </li><li> Dissolver IB pelotas em solução de guanidina (6 M de guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), utilizando-se 25-50 ml por litro de cultura processado. Esta etapa irá exigir várias horas com agitação e sonicação leve ocasional. </li><li> Limpar o lisado IB por centrifugação durante 1 hora a 75,000-100,000 xg e 20 ° C. Decantar o sobrenadante e filtra-se através de uma membrana de 0,2 | iM. </li><li> Combina-se o lisato limpo IB, num tubo cónico de 50 ml ou de um recipiente maior, que pode ser fechada de forma segura, com resina de afinidade de níquel que foi lavado com água e equilibra-se a solução de guanidina. Use resina 3-4 ml resolvido por litro de cultura processado por fusão que expressam a um grau similar como trpLE-DAP12TM aqui mostrado (Figura 3, pista 2). Ligam descontínuo, incubando durante a noite na sala de t<html> emperatura com mistura suave. </li></ol> 4. Na coluna de reticulação oxidativa <ol><li> Carregar o IB suspensão resina lisado / níquel em uma coluna vazia de fluxo por gravidade com o apoio leito poroso, adicionando continuamente até que todo o volume flui. Coletar e colocar de lado o fluxo contínuo, o que ainda pode conter proteína de fusão não ligado. </li><li> Lava-se a resina de níquel por escoamento por gravidade, com 5 volumes de leito de uma solução de ureia (ureia 8 M, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 200 mM), contendo 5 mM β-ME. </li><li> Lava-se a resina de níquel de novo com 5 volumes de leito de uma solução de ureia sem β-ME. </li><li> Lava-se a resina de níquel de uma terceira vez com 5 volumes de leito de uma solução de ureia que foi suplementado com 20 mM de CuSO4 e 2 mM de glutationa oxidada. Após esta lavagem, feche a saída da coluna e incuba-se 30 min à temperatura ambiente para permitir a formação de ligações dissulfureto máxima. </li></ol> 5. TFA eluição e Quantificação conteúdo &quot;&gt; ATENÇÃO: ácido trifluoroacético (TFA) provoca queimaduras graves em contacto com a pele e os vapores são altamente irritantes TFA concentrado deve ser usado apenas em um capuz químico aprovado fumos com óculos de proteção e luvas sem látex Verifique a compatibilidade química de todos.. materiais utilizados; polipropileno é compatível com todas as etapas deste protocolo. <ol><li> Lavar a solução de ureia a oxidante com 10 volumes de leito de água e secar o leito da coluna por aplicação de uma linha de vácuo para a saída da coluna. </li><li> Fechar a saída da coluna e adicionar 1,5 volumes do leito de puro (99-100%) de TFA. Agita-se a resina de níquel com uma pequena espátula para assegurar uma exposição a ácido e incubar durante 5 min. Abrir a saída da coluna e recolher o eluato ácido, pressurizando suavemente com uma seringa ou uma linha de ar comprimido, se necessário, para empurrar para fora de todo o líquido. </li><li> Repetir o passo de eluição do ácido com mais 1,5 volumes do leito de TFA puro. Trabalhar rapidamente nesta etapa, para evitar a dissolução completa do Beaded agarose matriz. Produção de proteína pode ser determinada, neste ponto de acordo com a equação de Beer-Lambert e o coeficiente de extinção molar teórica da sequência trpLE-péptido. Diluir a amostra do eluato de TFA (01:20 - 01:50), em trifluoroetanol (TFE) e medir a absorvência a 280 nm, utilizando-se TFA / TFE para a mesma diluição como um branco. </li></ol> 6. Digestão CNBr ATENÇÃO: O brometo de Cyanogen (CNBr) é extremamente tóxico e deve ser tratado apenas em um capuz químico aprovado fumos. PPE incluindo óculos de segurança, jaleco e luvas sem látex são absolutamente necessários. CNBr é reativa à umidade e deve estar à temperatura ambiente antes de abrir. Contacte o seu escritório de segurança institucional para obter instruções sobre a neutralização / eliminação de CNBr contaminados soluções e materiais. <ol><li> Dilui-se o eluato até à concentração de ácido de 80% TFA final por adição gota a gota de água enquanto se mistura com cuidado. Se se formar um precipitado, umadd volta de um pequeno volume (0,5 a 1 ml) de TFA puro, até a solução fique límpida, em seguida, re-corrigir a 80% com água. Tomar uma amostra de 5 ul de pré-digest por análise SDS-PAGE, a congelação em azoto líquido e a liofilização da amostra imediatamente. </li><li> Adicionar cristais de CNBr de aproximadamente 0,2 g / ml, tendo o cuidado para pesar o produto químico tóxico com segurança fechados, em pré-doseados tubos ou usando uma balança no interior do exaustor de fumos química. Misture suavemente até que esteja completamente dissolvido. Lavar e selar o recipiente de reacção sob atmosfera de gás inerte (azoto ou árgon fluxo) e incubar 3-4 horas à temperatura ambiente, protegida da luz. </li><li> Dê uma amostra de 5 pós digerir-ul de SDS-PAGE e congelar e liofilizar imediatamente. Transferir a reacção de digestão com uma cassete de celulose regenerada ou da tubagem de diálise (o acetato de celulose se dissolve em ácido concentrado), com um corte de peso molecular de 3,5 kDa, ou menos, de acordo com o tamanho do complexo de péptido esperado. Dializar durante a noite a 4 L de água nocoifa química para reduzir a concentração de TFA e decompor qualquer CNBr que não reagiu. Deixar espaço na cassete de diálise ou tubo de um aumento significativo no volume (tanto como duas a três vezes), durante a diálise durante a noite. </li><li> Remover a solução de reacção com dialisado precipitado suspenso a partir da cassete de diálise ou tubo (a maior parte da proteína irá precipitar quando a concentração de TFA é reduzido), e transferir a suspensão para tubos de 50 ml cónicas. Congelar e liofilizar para remover a água e vestígios de CNBr / TFA. Este passo é provável que requerem vários dias. ATENÇÃO: Tanto a reação digerir dialisado e da água de diálise deve continuar a ser tratada como tóxico e tratados / eliminados com as devidas precauções. </li><li> Amostras de culturas de fases de indução e de pré-colheita, de corpos de inclusão do sobrenadante e sedimento, eluído TFA e digerido CNBr-material pode ser analisada por SDS-PAGE. Preparar as amostras por meio de aquecimento a 95 ° C em Invitrogen NuPAGE LDS sampltampão e. TFA eluato e amostras digest deve ser preparada em condições tanto redutoras e não redutoras para facilitar a identificação do produto e avaliação de reticulação oxidativa. </li><li> Separa-se as amostras sobre um gel NuPAGE 12% Bis-Tris acrilamida pré-molde com MES SDS-tampão de corrida para resolução óptima dos produtos mais pequenos de resumo. </li></ol> 7. De fase reversa HPLC da purificação por dissulfureto reticulados complexos de péptido <ol><li> Dissolve-se a 100 mg de produtos liofilizados digest em 2-3 ml de ácido fórmico puro e carga para uma escala preparativa (21,2 x 150 mm) da Agilent ZORBAX SB-300 C3 coluna PrepHT em solvente A (tipicamente 10-20% de acetonitrilo e 5 -10% de isopropanol em água com 0,1% de TFA). </li><li> Eluir os produtos digest com um gradiente de solvente B (acetonitrilo ou isopropanol com 0,1% de TFA) ao longo de pelo menos 5 volumes de coluna. Veja a discussão para sugestões sobre a seleção de condições de gradiente ideais para seqüências de peptídeos diferentes. </li><li> Tomar50-100 ul de amostras de cada fracção de HPLC para a análise de SDS-PAGE e congelar e liofilizar imediatamente. A remoção dos solventes de HPLC é rápido e deverá estar completo em 1-2 horas. </li><li> Preparar as amostras liofilizadas de HPLC para SDS-PAGE, por aquecimento a 95 ° C em tampão de amostra Invitrogen NuPAGE LDS sem agente redutor. Arrefece-se e dividir cada amostra uniformemente em dois tubos de microcentrífuga, adicionando 100 mM de DTT para uma delas e re-aquecimento breve. </li><li> Separa-se as amostras reduzidas e não reduzidas por HPLC sobre uma NuPAGE 12% de gel de acrilamida tris-bis pré-molde com MES SDS-tampão de corrida, como acima. Pequenas, peptídeos hidrofóbicos muitas vezes não ocupam Coomassie mancha bem e pode não funcionar em seus esperados pesos moleculares. No entanto, a comparação das amostras reduzidas e não reduzidas deve facilitar a identificação dos produtos de péptidos com ligações cruzadas e de avaliação da pureza. </li><li> Analisar os péptidos candidatos fracções contendo por laser assistida por matriz de ionização de dessorção de tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa (ver discussão) para identificar as espécies de interesse e confirmar a sua massa esperada. </li><li> Combinar, congelar e liofilizar fracções de HPLC contendo o puro, complexo de péptido TM reticulado e ter um peso seco do produto final para determinar o rendimento. Frações com conteúdo isopropanol alta não podem permanecer congelados. Se as fracções peptídicas secar até uma película, em vez de um produto macio liofilizado, re-dissolve-se o filme completamente em um pequeno volume de puro hexafluoroisopropanol (HFIP), congelar e liofilizar novamente. O produto HFIP tratado deve ser um cone pequeno, branco, que é facilmente inclinada para fora e pesados. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

A expressão de fusões trpLE-TM. Na nossa experiência, trpLE-TM fusões são pobremente expressa em meio de cultura rico, a 37 ° C, e as condições de cultura aqui descritas tenham sido bem sucedida para muitas sequências diferentes contendo 1-4 domínios TM com rendimentos variando 50-150 mg / L de fusão pura e intacta. Codificação de fusões de três ou de quatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 e TM4-TM7, respectivamente) ou um fragmento do núcleo catalítico da peptidase sinal peptídeo h...

Este protocolo detalhes um procedimento que desenvolvemos para produzir complexos estabilizados por dissulfureto de transmembrana (TM) péptidos para estudos estruturais de RMN utilizando solução. O processo tira partido da expressão robusta proporcionada pelo sistema de fusão ΔtrpLE1413 (ver abaixo) e permite que os complexos de peptídeos de TM da composição definida para ser gerados usando técnicas sofisticadas de isótopos estáveis ​​de rotulagem para as modernas experiências de RMN multidimensionais. Nós empregamos essas técnicas para determinar as estruturas de RMN, que revelou várias novas e importantes informações sobre como linfócitos activadores immunoreceptors são montados a partir de subunidades de proteínas de membrana múltiplas através de interacções entre os seus domínios TM (recentemente revisto em 1). Estas técnicas são aplicáveis ​​a muitos outros sistemas de membrana de proteína, bem como uma grande variedade de métodos analíticos a jusante para além RMN solução. Enquanto o exemplo dado aqui utiliza resíduos de cisteína nativospara criar um complexo que imita o naturalmente ligado por dissulfureto da proteína, a concepção é igualmente adequado para a criação de pontes de dissulfureto para estabilizar complexos de engenharia que são normalmente mantidas juntas por mais fracas, de interacções não covalentes tais como homo-e hetero-dímeros de complexos TM receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) da família de proteínas ou complexos de 2-4 heterodiméricos αβ integrina 5,6. Extremamente hidrofóbicos sequências de péptidos tais como os derivados a partir da bicamada lipídica que mede porções de proteínas TM são assuntos extremamente difíceis para estudos bioquímicos e biofísicos. Para além de ser muito difícil de manipular utilizando proteína padrão e técnicas de química de péptidos, são frequentemente muito tóxicos para as células e, portanto, são difíceis de produzir por via recombinante. Nós e outros 7,8 9-11 têm tido um sucesso significativo expressar tais sequências peptídicas difíceis em bactérias tal como no quadro-carboxi-terminalfusões com uma versão modificada da sequência ΔtrpLE1413 derivado da E. coli operão trp 12. O polipéptido ~ 13 kDa trpLE codificada por esta sequência pode ser produzido em níveis elevados no âmbito de um promotor T7 e é totalmente localizado para corpos de inclusão em que os problemas relacionados com a toxicidade e / ou de instabilidade são contornadas. Modificação da sequência, por adição de um ácido amino-terminal 9 de histidina-tag 13 e eliminação de resíduos internos de metionina e cisteína da sequência de 14 trpLE permitidos trpLE peptídicos fusões de ser purificadas por cromatografia de afinidade de metal-ião e digerido com brometo de cianogénio (CNBr ) para libertar a sequência peptídica desejada. Temos utilizado com sucesso este sistema para expressar mais de uma dúzia de diferentes seqüências como fusões trpLE representam fragmentos de proteínas de membrana que contêm até quatro domínios TM (7,8 e resultados inéditos, ver também seção de discussão). Oinovação chave neste protocolo é a identificação das condições em que os não estruturados e muito pouco solúvel trpLE-TM fusões podem ser eficientemente dissulfureto reticulado no contexto de um fluxo de trabalho simplificado. Vários aspectos da expressão de elevado rendimento, manipulação e purificação de produtos peptídicos foram também cuidadosamente optimizadas, e as recomendações aqui apresentadas são igualmente relevantes para a produção de não-reticuladas de dissulfureto (monomérico) Produtos TM peptídicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Brometo de cianogénio </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> Substância perigosa. Mercadorias perigosas. Muito tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. O contato com ácidos liberta gases muito tóxicos. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático. </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, número CAS 76-05-1 </td><td> Substância perigosa. Mercadorias perigosas., Provoca queimaduras graves. Nocivo por inalação. Nocivo para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no ambiente aquático. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, número CAS 60-24-2 </td><td> Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Irritante para a pele. Risco de lesões oculares graves. Pode causar sensibilização em contacto com a pele. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Número do produto 52512, CAS. 920-66-1 </td><td> Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Nocivo por inalação e ingestão. Causa queimaduras. </td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Líquido inflamável e vapor. Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Número de Produto, 817, CAS 57-13-6 </td><td> Quando aquecido, dezembroomposes de dióxido de carbono e amónia; se queimado, emite pequenas quantidades de óxidos de azoto. Pode causar vermelhidão e irritação da pele e dos olhos. </td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Número CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo se ingerido, causa irritação ocular grave, provoca irritação da pele, toxicidade oral aguda, irritante da pele Irritante aos olhos. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Número-T8532 produto CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 é um detergente não iónico, 100% do ingrediente activo, que é muitas vezes utilizado em aplicações bioquímicas para solubilizar as proteínas. Triton X-100 não tem propriedades antimicrobianas e considerado como um detergente comparativamente suave não desnaturante </td></tr><tr><td> Sua-Select gel níquel-Affinity </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catálogo Num-P6611 </td><td> IS-Select Gel de Afinidade O níquel é um produto de metal imobilizado iões de cromatografia de afinidade (IMAC). O Nick HIS-Selectel gel de afinidade é um quelato de propriedade quadridentado em agarose frisado carregada com níquel, que é concebido para ligar especificamente proteínas contendo histidina. </td></tr><tr><td> (-)-Glutationa, oxidado </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Num catálogo 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix sonicador S-3000 </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (descontinuado) </td><td> Potência máxima de 600 watts. Ponta da sonda substituível 1,2 cm leva 1,2 cm de alta intensidade, alto volume de dicas e uma gama de alta intensidade, baixo volume dicas. Mais próximos modelos atualmente disponíveis nesta empresa são Q500 e Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: BioLogic sistema de cromatografia DuoFlow, versão de software 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Num catálogo 760-0047, Config Não: AU500571, No de série: 484BR3705 </td><td> Liga-se a péptidos de colunas de fase reversa de HPLC em alta aqfase móvel ueous e são eluídos de colunas de RP HPLC com fase orgânica elevada móvel. Em RP HPLC péptidos são separados com base no seu carácter hidrófobo. Os péptidos podem ser separados através da execução de um gradiente linear de solvente orgânico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-coluna analítica de HPLC, de 21,2 x 150 mm, tamanho de partícula 5 | iM </td><td> Agilent </td><td> Não Produto: 895150-909 </td><td> HPLC em fase reversa colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gels </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Pré géis elenco para eletroforese de proteínas </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Cassetes diálise, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nenhum produto: 87724 </td><td> Amostra de diálise </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interacções físicas entre os lípidos incorporados alfa-helicoidais domínios de proteínas da membrana desempenham um papel crucial na dobragem e montagem de complexos de proteínas de membrana e em processos dinâmicos, como transmembranar (TM) de sinalização e regulação dos níveis de proteína da superfície celular. Compreender as características estruturais de condução a associação de seqüências particulares requer sofisticadas análises biofísicos e bioquímicos de complexos peptídeo TM. No entanto, a hidrofobicidade extrema de domínios TM torna-os muito difíceis de manipular utilizando técnicas de química de péptidos e a produção de material de estudo adequado muitas vezes se torna proibitivamente desafiador. Identificando as condições sob as quais os péptidos podem adoptar conformações helicoidais estáveis ​​e formam complexos espontaneamente acrescenta outro nível de dificuldade. Apresentamos aqui um processo para a produção de homo-ou hetero-dímeros de complexos de peptídeos de TM a partir de materiais que são expressas em E. coli, o que permite a incorporação de etiquetas de isótopos estáveis ​​para a ressonância magnética nuclear (RMN), ou não naturais, ácidos aminados para outras aplicações de forma relativamente barata. A principal inovação neste método é que os complexos de TM são produzidos e purificados como covalentemente associadas (dissulfureto reticulado) montagens que podem formar estruturas estáveis, estequiométrica e homogéneo, quando reconstituído em lípido detergente, ou outros materiais de membrana-miméticos. Nós também apresentamos procedimentos cuidadosamente otimizados para expressão e purificação que são igualmente aplicáveis ​​se produzir domínios únicos TM ou complexos reticulados e dar conselhos para adaptar estes métodos para novas seqüências TM.

O nível de expressão obtido para fusões trpLE é variável e fortemente dependente da sequência de amino-ácido do péptido ligado. Figura 3 mostra a análise de SDS-PAGE de pré-indução (pista 1) e de tempo de colheita (pista 2) As amostras de uma cultura que produziu aproximadamente 120 mg de puro, fusão trpLE-DAP12TM intacta a partir de 1 litro de cultura e de 4 ml de matriz de níquel. Toda a fusão trpLE-DAP12TM foi localizado para a inserção do corpo de pelotas (pista 4), em oposição ao...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K visualizações.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíti...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Química

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

Controlado por polimerização de anel de abertura Photoredox do - Carboxyanhydrides, mediada por complexos de Ni/Zn

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Preparação de Íons Aziridínio Bicíclicos Estáveis e sua Abertura de Anel para a Síntese de Azaheterociclos

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Novas técnicas para observar a dinâmica estrutural de cristais líquidos de Photoresponsive

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

Preparação de Complexos modelo sns cobalto(ii) de álcool hepático desidrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.