Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Bioengenharia e Ciências Terapêuticas da UCSF, o instituto de Califórnia para Quantitativos Biociências (QB3), eo Bridging the Gap Prêmio da Fundação Rogers Família.

1. Projeto do dispositivo Dimensões e Topologias Baseado Experimental necessidades usando Computer Aided Design (CAD) Software Nota: Selecção diâmetros dos canais de emulsão mais pequenas do que as das gotículas esféricas. Isso força as gotículas para um cilíndrico ou &quot;salsicha&quot; forma e permite picoinjection mais eficaz. Para os nossos propósitos, nós projetamos 30 x 30 mm canais de gotículas que eram de 50 m de diâmetro. <ol><li> Local picoinjection Modelo (s) depois de os descritos por Abate et al. 3 com a excepção de que os canais para os eléctrodos de metal são removidas, como eles são desnecessários. </li><li> Adicionar canais para servir como o fosso de Faraday (Figura 1), que funcionam entre o local picoinjection (s) e a emulsão a montante de tal forma que eles protegem as gotículas do campo eléctrico. Nota: Este impede fusão não intencional. </li></ol> 2. Dispositivos Fabricar com SOFT fotolitoTécnicas ographic <ol><li> Gerar uma máscara de transparência fotolitografia com base no arquivo CAD usando serviços comerciais existentes. </li><li> Com a foto-mascara, curar fotorresistente em bolachas de silício para produzir um dispositivo mestre, tal como descrito anteriormente 4. </li><li> Despeje PDMS misturado com agente de cura (proporção 11:1) sobre o mestre dispositivo contido em um cinco centímetros de poliestireno placa de Petri. </li><li> Colocar o mestre com PDMS em um exsicador de vácuo durante cerca de 15 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Curar o dispositivo de PDMS, colocando-o num forno de 95 ° C durante 1 hora. Em alternativa, o PDMS irá curar à RT após 24 horas. </li><li> Remova o dispositivo, cortando todo o perímetro com uma lâmina cirúrgica e descascando cuidadosamente o dispositivo com o mestre. </li><li> Soco entrada e saída buracos nas PDMS usando uma biópsia de 0,5 mm. </li><li> Ligar o dispositivo a uma lâmina de vidro usando um bonder plasma 4. </li></ol> 3. Prepare uma pressão de arPump Control para pressurizar um reservatório contendo o Fluido <ol><li> Modificar a saída da bomba de tal modo que as saídas de ar comprimido através de um comprimento de tubo de polietileno de 2,7 milímetros de diâmetro interno. </li><li> Construí-la de modo a que a tubagem termina numa seringa de ponta luer-lock ajustando a luz sobre o mamilo na parte traseira do luer. </li><li> Selar preenchendo o espaço entre os fios de luer-lock e a tubagem com epóxi. </li><li> Coloque uma agulha 27,5 G. </li></ol> 4. Preparar uma Monodisperse emulsão aquosa de Gotículas (água-em-óleo) em suspensão em um portador inerte fluorado óleo com 2% (p / p) dissolvido biocompatível Surfactante 7 Os reagentes específicos contidos nestas gotas dependem da aplicação <ol><li> Em preparação para a reinjecção, carregar a emulsão para uma seringa de 1 ml com uma agulha G 27,5. </li><li> Fixe a seringa em uma bomba de seringa e orientar a bomba vertical (agulha para cima). NotaEsta orientação faz com que as gotículas de embalar numa camada acima do óleo veicular. Quando a bomba está a funcionar, as gotículas irá ser empurrado para fora da seringa na fracção de elevado volume da camada de óleo por baixo deles. </li></ol> 5. Prepare Reagentes para Introdução ao chip microfluídico <ol><li> Perfurador três furos 0,5 milímetros para dentro da tampa de um tubo de centrífuga de 15 ml (um recipiente com uma tampa de rosca é suficiente) utilizando um perfurador de biópsia de agulha, ou broca. </li><li> Inserir um eléctrodo de arame de diâmetro de 0,5 mm e um cm de comprimento de tubagem de PE-2 ~ 20 através de dois dos furos de modo a que eles cheguem ao fundo do tubo. </li><li> No buraco restante, passe um ~ 2,5 centímetros de comprimento cm de tubos PE ~ 20 de tal forma que ele vai descansar acima do nível do fluido. </li><li> Vede todas as aberturas na parte superior da tampa com epóxi UV-curado. </li><li> Encha o tubo com o fluido picoinjection e parafuso na tampa. </li><li> Ligue a saída a partir da bomba de controle de pressão de ar com o comprimento mais curto de tubagem por inserçãoção da agulha para dentro do lúmen. A agulha deve caber confortavelmente. </li><li> Encher uma seringa de 1 ml com 1 M de NaCl para servir como o fosso de Faraday. </li><li> Conecte um G agulha 27,5 e segura a seringa em uma bomba de seringa. </li><li> Encha uma outra seringa de 1 ml com óleo do portador / espaçador, conecte uma agulha G 27,5, e fixá-lo em uma bomba de seringa. </li></ol> 6. Prepare o dispositivo micro para Picoinjection <ol><li> Ligar o tubo de saída (mais de comprimento) a partir do recipiente de fluido de injecção para a porta de entrada do fluido picoinjection no chip de microfluidos. </li><li> Ligar a seringa contendo a 1 M de NaCl para a porta de entrada para o fosso de Faraday no chip de microfluidos com um comprimento de tubagem de PE. </li><li> Ligar a seringa contendo o óleo do portador para a porta de entrada do chip de microfluidos com um comprimento de tubagem de PE. </li><li> Inserir tubos PE na porta de saída de emulsão sobre o chip de microfluidos. A tubulação deve terminar em um reservatório de recolha de emulsão, nemmalmente um tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Insira o tubo PE na porta de saída para o Faraday Moat no chip microfluídico. A tubulação deve terminar em um não-condutor e recipiente isolado eletricamente para evitar um curto-circuito. </li><li> Ligue a saída do amplificador de alta voltagem (HV) através de jacaré ao eléctrodo de metal submergido no fluido picoinjection. </li><li> Conecte o eletrodo de aterramento do amplificador HV via jacaré para o metal da agulha da seringa contendo o 1 M NaCl. </li></ol> 7. Infundir Reagentes para Microfluidic Chip <ol><li> Introduzir a 1 M de NaCl (Moat Faraday) para o dispositivo, a uma taxa de 100 il / hr. </li><li> Introduzir a emulsão de gotas e transportadora de petróleo a preços adequados para as dimensões do dispositivo. Para o nosso dispositivo de demonstração, apresentamos as gotas de óleo e de 200 e 400 mL / h, respectivamente. As taxas de fluxo deve permitir que as gotas para passar o picoinjector em intervalos regulares separadaspor um intervalo de óleo do portador. </li><li> Ajustar a pressão aplicada ao fluido picoinjection tal que a pressão do fluido no orifício picoinjection está em equilíbrio mecânico com o canal de gotícula. Nota: A esta pressão (a pressão de Laplace), o fluido de injecção deve inchar dentro do canal de gotículas sem brotando e formando as suas gotas (Figura 2). A estas taxas de fluxo acima descritas, que se aplica uma pressão de ~ 13 psi para o fluido de injecção para atingir o equilíbrio no local da injecção. </li></ol> 8. Comece Picoinjection <ol><li> Como as gotas passam pelo orifício de injecção, aplica um 0-10 V, 10 kHz, o sinal AC amplificada 1000 x por HV-amplificador (Figura 3). </li><li> Modular o volume de injecção, alterando a amplitude da tensão aplicada. Nota: As tensões mais elevadas deve permitir mais fluido a ser introduzido para as gotículas. Em nossos testes, observamos injeção estável e consistente com tensões serentre 100 e 3000 V usando soluções de injecção de NaCl variando 10-500 mM (Figura 4). </li></ol>

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	<li>Kritikou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It's+cheaper+in+the+Picolab.">It's cheaper in the Picolab.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).</li><li>Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrocoalescence+of+drops+synchronized+by+size-dependent+flow+in+microfluidic+channels.">Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).</li><li>Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+injection+with+microfluidics+using+picoinjectors.">High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).</li><li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+microfluidic+device+for+the+compartmentalization+of+neuron+soma+and+axons.">Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons.</a> J. Vis. Exp. (7), (2007).</li><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).</li><li>O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrode-free+picoinjection+of+microfluidic+drops.">Electrode-free picoinjection of microfluidic drops.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).</li><li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions.">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li><li>Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+dynamics+passing+through+obstructions+in+confined+microchannel+flow.">Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow.</a> Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).</li><li>Herminghaus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+instability+of+thin+liquid+films+between+conducting+media.">Dynamical instability of thin liquid films between conducting media.</a> Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).</li><li>Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+electrocoalescence+in+microfluidics:+Targeting+a+single+lamella.">Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella.</a> Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).</li><li>Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrowetting-controlled+droplet+generation+in+a+microfluidic+flow-focusing+device.">Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device.</a> J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li></ol>

Nós não entendemos completamente mecanismo físico exato por trás da relação entre a tensão aplicada eo volume de injeção observado em nossos experimentos. Os interesses do laboratório e áreas relevantes do conhecimento não são bem adequados para a prossecução desta pergunta persistente. Nós encorajamos aqueles com mais física e perspicácia de engenharia para explorar este fenômeno.

A relação entre o volume de injecção e a tensão aplicada dependem de muitos factores, incluindo as dimensões do dispositivo, o comprimento do tubo que transporta o fluido picoinjection para o dispositivo, a molaridade de fluido picoinjection, e a velocidade das gotas, quando passam eles injector. Por este motivo, recomendamos que a relação de volume / tensão ser caracterizado antes de cada execução de picoinjection medindo volumes de injecção nas bordas das faixas de trabalho da tensão e molaridade. Além ...

Em microfluídica baseada em gotículas, gotículas aquosas escala mícron são usados ​​como &quot;tubos de ensaio&quot; para reações biológicas. A vantagem para a realização de reacções nas gotículas é que cada gota usa somente um poucos pl de reagente e, com a microfluidos, as gotas podem ser formadas e processadas em taxas kilohertz 1. Em conjunto, estas propriedades permitem que milhões de reacções com células individuais, moléculas de ácidos nucleicos, ou compostos a serem realizadas numa questão de minutos, com ul de material total. Para usar gotas para aplicações como estas, são necessárias técnicas para a adição de volumes controlados de reagentes para as gotas; tais operações são análogas às pipetando em tubos de ensaio. Um método para realizar isto é electrocoalescence, em que uma gota de reagente é fundida com a queda alvo através da aplicação de um campo eléctrico. O campo eléctrico perturba o arranjo de moléculas de surfactante sobre os interfaces das gotas, inducing uma instabilidade de película fina e provocando a coalescência em emulsões que são de outra maneira estável 2. Fusão induzidos electricamente é igualmente explorada no design do picoinjector, um dispositivo que injecta os reagentes em gotas à medida que fluem através de um canal pressurizado 3. Para aplicar o campo eléctrico, dispositivos picoinjector utilizar eléctrodos metálicos, mas a integração de eléctrodos metálicos em chips de microfluidos é geralmente um processo complexo e propenso a erros como os fios de líquido da solda são facilmente comprometidos por bolhas de ar ou poeira e outros detritos no canal , bem como fraturas de estresse ou flexão durante a configuração do dispositivo. Aqui é apresentado um método para realizar picoinjection sem a utilização de eléctrodos de metal, tornando o fabrico mais simples e mais robusto. Para acionar picoinjection, nós em vez usar o próprio fluido de injeção como um eletrodo, uma vez que a maioria dos reagentes biológicos contêm eletrólitos dissolvidos e são condutores. Nós também adicionar um &quot;Faraday Moat &quot;para proteger as regiões sensíveis do dispositivo e actuam como uma base universal (Figura 1). O fosso isola electricamente as gotículas a montante do local picoinjection proporcionando um solo, impedindo fusão gotícula não intencional. Um benefício adicional da nossa técnica é que o volume injectado nas gotas depende da magnitude da tensão aplicada, permitindo-lhe ser ajustado por meio do ajuste do sinal aplicado. Nós fabricamos os nossos dispositivos de poli (dimetilsiloxano) (PDMS), utilizando técnicas de fotolitografia suave 4,5. Nossa abordagem é compatível com dispositivos fabricados em outros materiais, como resinas, plásticos e epóxis. Os canais têm alturas e larguras de 30 mm, que são óptimas para o trabalho com gotas de 50 mm de diâmetro (65 pl). Nós introduzimos reagentes através de tubos polietileno (0.3/1.09 mm de diâmetro interno / externo) inserido portos criados durante fabricação de dispositivos com 0,50 milímetros socos biópsia, semelhantes aos métodos described anteriormente 5. A composição exacta do fluido de injecção, depende da aplicação específica. O fluido só necessita conter electrólitos dissolvidos em concentrações suficientemente elevadas para produzir condutividade suficiente para o sinal eléctrico a ser transmitido para o picoinjector. No teste de bancada, verificou-se que as concentrações iónicas superiores a 10 mm deve ser suficiente 6, embora este valor e condutividades fluido dependem das dimensões dos dispositivos específicos e magnitude da tensão aplicada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1 mL Leur-Lok&#8482; syringes</td>
			<td style="width:143px;">BD Medical</td>
			<td align="right" style="width:160px;">309628</td>
			<td style="width:415px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LocTite UV-cured adhesive</td>
			<td style="width:143px;">Henkel</td>
			<td align="right">35241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">PE-2 Tubing</td>
			<td style="width:143px;">Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Novec HFE-7500</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:160px;">98-0212-2928-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">22363531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BD Falcon 15 ml tube</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:160px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Air Pressure Control Pump</td>
			<td style="width:143px;">Control Air Inc.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:415px;">We recommend one under the control of DAQ and control software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe Pumps</td>
			<td>New Era</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>Must be capable of holding 1ml syringes and flowing at rates as low as 100 uL/hr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">HV-Amplfier</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>Must be capable of 1000x amplification of signals between 0.01 and 10 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma Bonder/Cleaner</td>
			<td style="width:143px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3&#8221; silicon wafers</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:160px;">647535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDMS</td>
			<td style="width:143px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>Sylgard 184 with curing agent should be included</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">SU-8 Photoresist</td>
			<td style="width:143px;">MicroChem</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>Viscocity depends on device dimensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

picoinjection of microfluidic drops without metal electrodes

Métodos para picoinjecting reagentes em gotas microfluídicos existentes requerem eletrodos metálicos integrados ao chip microfluídico. A integração destes eletrodos acrescenta passos pesados ​​e propensos a erros no processo de fabricação do dispositivo. Desenvolvemos uma técnica que elimina a necessidade de eléctrodos metálicos durante picoinjection. Em vez disso, ele usa o próprio fluido de injeção como um eletrodo, uma vez que a maioria dos reagentes biológicos contêm eletrólitos dissolvidos e são condutores. Ao eliminar os eletrodos, que reduzem o tempo de fabricação de dispositivos e complexidade, e tornar os dispositivos mais robustos. Além disso, com a nossa abordagem, o volume de injecção depende da tensão aplicada à solução picoinjection; isso permite ajustar rapidamente o volume injectado por modulação da voltagem aplicada. Nós demonstramos que a nossa técnica é compatível com os reagentes que incorporam compostos biológicos comuns, incluindo tampões, enzimas e ácidos nucleicos.

As imagens microscópicas feita no local picoinjection mostram que a electrificação do fluido picoinjection é suficiente para desencadear a injecção (Figura 2). O volume injectado pode ser controlada por meio da modulação da amplitude da voltagem aplicada, com tensões mais elevadas que permitam a volumes de injecção mais elevadas. Marcamos o volume de injecção contra a magnitude da voltagem aplicada durante três molaridades representativos de fluido de injecção na (Figura 3).</str...

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Picoinjection of Microfluidic Drops Without Metal Electrodes

Desenvolvemos uma técnica para picoinjecting gotas de microfluidos que não necessitam de eléctrodos metálicos. Como tal, os dispositivos que incorporem a nossa técnica é mais simples de fabricar e de utilizar.

Picoinjection de Microfluidic Drops sem metal Eletrodos

Existing methods for picoinjecting reagents into microfluidic drops require metal electrodes integrated into the microfluidic chip. The integration of ...

picoinjection-of-microfluidic-drops-without-metal-electrodes

Research

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Engineering

11.0K visualizações.  Unversity of California, San Francisco.  Desenvolvemos uma técnica para picoinjecting gotas de microfluidos que não necessitam de eléctrodos metálicos. Como tal, os dispositivos que incorporem a nossa técnica é mais simples de fabricar e de utilizar. 