Agradecemos Kristin Johnson para o trabalho gráfico.

Todos os protocolos que envolvem animais são apresentadas e aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional do Hospital Infantil de Boston e são conduzidas de acordo com as recomendações da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC). Certifique-se de usar a instrumentação estéril e techniqure asséptica durante a realização do procedimento. 1 Preparação de peletes <ol><li> Pesar 10 mg de sucralfato e 60 mg de Hydron com a espátula unbent estéril. Coloque em microtubos separados. </li><li> Coloque um pedaço quadrado de 1 cm da malha em um estéril prato de 10 cm. Inverter tão malha repousa sobre tampa rasa. Reserve. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol para o hídron vórtice e para, pelo menos, 10 min. </li><li> Adicionar a quantidade apropriada de factor de crescimento (padrão: 20 mg para o bFGF, 50 ng de VEGF) para o sucralfato e vortex brevemente. Fator de crescimento da loja em um-80 ° C congelador a uma concentração de 1 mg / ml. Volumes de líquido adicionados deve ter um mínimo de 20 ul de assegurar o sucralfato é totalmente humedecido mas não deve exceder 50 ul. Maior volume faz com que a evaporação do líquido no próximo passo difícil. </li><li> Coloque a mistura de sucralfato no evaporador centrífugo definido em baixo até que a mistura está completamente seco, normalmente de 30-50 minutos, dependendo do volume do líquido utilizado. <ol><li> Verificar-se a mistura para a humidade residual com a extremidade cónica de uma espátula esterilizada. A mistura deve se sentir &quot;crocante&quot;. </li></ol></li><li> Utilizar a extremidade pontiaguda da espátula para separar a mistura de sucralfato no interior do tubo. </li><li> Adicionam-se 10 ul da hídron ao sucralfato. <ol><li> Devido à natureza viscosa de Hydron, cortar a extremidade de uma pipeta de ponta de 200 mL e, em seguida, extrair e libertar os 10 ul antes pipetando para cima e de novo para a adição de sucralfato. </li></ol></li><li> Rapidamente use briga dobradoula para misturar o Hydron e sucralfato e retire do tubo. <ol><li> Reunir a mistura ao longo do lado inferior da ponta de uma espátula e, em seguida, dobrado rodar o tubo, enquanto o desenho da espátula para fora ao longo da parede do tubo. A mistura vai secar rapidamente assim que esta etapa deve ser feito de forma eficiente. </li></ol></li><li> Espalhe a mistura sobre a malha preparado usando uma pinça para segurá-la no lugar. A mistura deve ser uma camada uniforme e encher os orifícios da malha. </li><li> Imergir a espátula dobrada para dentro do tubo que contém hídron e usá-lo revestimento de ambos os lados da malha. </li><li> Coloque a malha revestido inclinando-se sobre o lado contra borda do prato e deixe secar à temperatura ambiente durante 30-45 min. </li><li> Coloque a malha em freezer -20 ° C ou proceder de imediato para a próxima etapa. Mantenha malha dentro prato. </li><li> Coloque prato de 35 mm no interior do prato de petri maior, tampa. Utilizar o par de pinças para puxar cuidadosamente as fibras da malha entre si sobre o prato 35 milímetros. Pelotas Stray cum ser recolhidos a partir do prato maior no final. <ol><li> Verifique pelotas para a uniformidade sob escopo. O processo produz cerca de 250 pastilhas, assim, a dose padrão por pellet de bFGF e VEGF é de 80 ng e 200 ng, respectivamente. </li></ol></li><li> Pelotas de lojas em 35 milímetros prato em freezer -20 ° C por até 3 meses. </li></ol> 2. implantação cirúrgica de Pelotas <ol><li> Configurar uma área cirúrgica sob microscópio cirúrgico. </li><li> Anestesiar o mouse com avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) e posicione o mouse sob o microscópio para que olho é visível. Realize toe pitada de garantir um nível suficiente de anestesia. </li><li> Anestesiar o olho do rato, colocando uma gota de solução proparacaina cima globo ocular. Aguarde 20-30 segundos e bata com uma compressa de gaze. </li><li> Proptose o olho do rato com o # entorpeceu um joalheiro fórceps sendo certo para deixar a pele entre fórceps e olho. É importante para avaliar a pressão aplicada correctamente.60; Segurando o olho com muita força fará com que ele se torne vermelha e irritada, enquanto muito solta um porão permitirá que olho para mover durante a cirurgia. </li><li> Utilizar a 30 ° microlanceta para fazer uma incisão na córnea de aproximadamente 1 mm do limbo. A incisão deve ser de 1-2 mm de comprimento. Incisão deve ser profundo o suficiente para penetrar além da camada epitelial em midstroma mas não tão profundamente para romper o olho. </li><li> Utilizar a faca von Graef para fazer um bolso perpendicular à incisão. <ol><li> Deslize a faca sob a camada córnea no local da incisão e trabalhar suavemente faca e movê-lo ao longo da incisão para ampliar o espaço, formando assim o bolso. Isso ajuda a mover o rato, assim como para ser capaz de trabalhar com a curvatura do olho. Tenha cuidado para não empurrar para baixo com a ponta para evitar a ruptura do olho. </li></ol></li><li> Molhe o fórceps # 5 do joalheiro com proparacaina e pegar uma bolinha para fora do prato. Coloque um sedimento no olho. </li&gt; <li> Umedeça a faca von Graef com proparacaina e transferir algumas de líquido sobre pellet para torná-lo elástico e flexível. Retire o excesso de umidade com gaze ou cotonete. </li><li> Insira o pellet no bolso usando a faca von Graef para empurrá-lo para dentro abaixo da camada córnea. Uma vez que todo o sedimento está dentro, execute o lado plano de von Graef faca sobre o local para verificar se o pellet é segura. </li><li> Cubra o olho com pomada antibiótica tripla. </li><li> Vire o mouse e repetir a cirurgia no olho oposto. </li></ol> 3 Quantificação de neovascularização da córnea. Deixe os animais para desenvolver vasos durante um determinado período de tempo. O dia de peneiração navio depende do factor de crescimento utilizado. Grau de bFGF no dia 5 e o mais fraco de VEGF no dia 6 o dia da implantação é o dia 0. <ol><li> Anestesiar o mouse com avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal). </li><li> Use o microscópio lâmpada de fenda para grading. Uma ocular tem uma retícula, linhas dentro da ocular usado como um auxílio de medição para quantificar comprimento do vaso e distância ao redor da circunferência do olho que as embarcações surgiram. <ol><li> Mantenha o mouse na frente do escopo, posicionando o mouse para que olho é visto na ocular com pellet em frente. Estabilize a cabeça entre o polegar eo dedo indicador de modo a pele é apertada no rosto e olho é ligeiramente proptose. </li></ol></li><li> Colocar o eixo y do retículo ao longo do vaso de limbo directamente abaixo do pellet. Meça o comprimento dos navios de ramificação para cima em direção pellets. Grave esta medida em décimos de milímetros e designar comprimento do vaso (VL) (Figura 1A). </li><li> Vire o mouse ou a bolsa para que a distância ao redor do olho que estes navios têm brotou se torna claro. É mais fácil pensar no olho, como um relógio, com intervalos de 1 a 12 designar este número relógio hora (CH) (Figura 1B). Ele pode ser um número inteiro ou fracções de 0,25 (por exemplo, 2, 2,25, 2,5 ou 2,75). Nota: CH é subjetiva. Por exemplo, alguns podem medir a distância em torno do olho para incluir todos os vasos germinados a partir do limbo, enquanto outros podem parar a medição no ponto onde o comprimento embarcação é metade máxima. O importante é ser consistente com a forma como se escolhe a classe. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Figura 1 A quantificação da neovascularização da córnea. (A) de 80 ng de bFGF pelota implantada em ratos C57BL / 6J rato mostrando lâmpada de fenda retícula orientada para medir o comprimento do navio. VL = 0,9 mm. (B) O mesmo mostrando olho lâmpada de fenda bolsa rodada para medir relógio hora. CH = 3,25. Área do vaso Calculado = 1,84 milímetros 2. Estas imagens digital ter sido aumentada para permitir a adição de esquema bolsa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada.</a> <ol start="5"><li> Calcule a área do vaso (VA) usando a fórmula a seguir, que é baseado na área de uma oval (Nota, é útil para manter isso em mente quando de classificação.) Expresso VA em milímetros quadrados. A fórmula é a seguinte: Hora x 0,2 π = área navio navio comprimento x Relógio </li></ol>

<ol>
	<li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells:+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent.">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li><li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells.">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+phorbol+esters+induce+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro.</a> Cell. 42, 469-477 (1985).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).</li><li>Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+angiogenesis+in+vitro:+light+microscopic,+ultrastructural,+and+radioautographic+studies.">Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies.</a> In Vitro. 18, 538-549 (1982).</li><li>Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+models+of+vascular+functions.">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).</li><li>Sandison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+microscopic+study+of+living+growing+tissues+by+the+introduction+of+a+transparent+chamber+in+the+rabbit's+ear.">A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear.</a> Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).</li><li>Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+angiogenesis+assays:+progress+and+problems.">Quantitative angiogenesis assays: progress and problems.</a> Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).</li><li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay.">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).</li><li>Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+in+vivo+by+prevention+of+neovascularization.">Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization.</a> J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+growth+and+neovascularization:+an+experimental+model+using+the+rabbit+cornea.">Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea.</a> J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).</li><li>Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+heterogeneity+of+angiogenesis+in+mice.">Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice.</a> FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).</li><li>Chang, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia.">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li><li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice.">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem várias etapas críticas realização de um ensaio de córnea bem sucedido. A primeira é fazer pellets uniformes, capazes de ser implantado e estimular vasos. As partes mais importantes da preparação de pelotas são 1), utilizando o factor de crescimento isento de transportador; 2) garantir uma boa mistura de fator de crescimento com o sucralfato e Hydron e 3) movendo a mistura final rapidamente, mas cuidadosamente do tubo eppendorf à malha, onde as pelotas são lançados. Recomenda-se que os aglomerados de ...

O processo de angiogênese, formação de novos vasos sanguíneos formam os pré-existentes, é altamente complexa e é regulada por vários fatores endógenos que controlam diferentes etapas do surgimento navio e morfogênese. A angiogênese é acionado devido a uma mudança no equilíbrio entre fatores pró e anti-angiogênicos, um equilíbrio que normalmente mantém a vascularização em um estado inativo. A angiogénese ocorre em adultos em determinadas condições fisiológicas tais como durante o ciclo do ovário ou do sexo feminino em processos de reparação, tais como cicatrização de feridas e regeneração de tecidos. No entanto, é também uma característica de várias patologias, incluindo neoplasias, doenças autoimunes e doenças inflamatórias. O envolvimento da angiogênese nestas condições fisiológicas e patológicas torna um assunto importante para a pesquisa e um alvo atraente para a terapia. Devido à complexidade da angiogênese e do envolvimento de vários cells e fatores no processo, incluindo as células endoteliais, pericitos, células circulantes e células do estroma, in vitro modelos continuam a ser limitados e não pode recapitulam o microambiente única in vivo. A principal ensaios in vitro de angiogênese são amplamente focada na observação de efeitos diretos sobre as células endoteliais e medir determinadas etapas no processo de angiogênese em condições controladas. Estes ensaios incluem a quantificação da proliferação celular endotelial 1, migração 2, a formação da rede 3, a formação do tubo 4 e brotação de esferóides 5. Modelos ex vivo, ao contrário dos in vitro, são mais complexos e incorporar vários tipos de células de tecido, por exemplo, ser o ensaio do anel aórtico 6. No entanto, como os outros sistemas, que podem não captar a contribuição de células circulantes e o estroma natural das células endoteliais como existe in vivo. Tentativaspara estudar a angiogênese sob fluxo para imitar o ambiente in vivo são realizados utilizando sistemas microfluídicos 7, no entanto, mesmo esses ensaios, embora muito melhor, ainda não consegue dar conta de todos os compartimentos existentes in vivo. Devido às limitações do in vitro, ex vivo e modelos de angiogénese, em modelos in vivo, continuam a ser as escolhas mais fiáveis ​​para estudos de angiogénese. Exemplos destes modelos incluem a implantação de câmaras transparentes, &quot;janelas&quot;, que permitem a visualização de vasos sanguíneos que crescem sob microscópio 8, implantes subcutâneos injectáveis, tais como a formação de matrigel e recipiente em tecidos normais, tais como a orelha de rato e da membrana corioalantóica de frango (CAM ). No entanto, um dos modelos de angiogénese in vivo mais aceitáveis ​​e quantitativos é o ensaio de microbolsa neovascularização descrito aqui, o qual explora o naturalmente avascularcórnea como uma &quot;tela&quot; para visualizar e avaliar o novo crescimento angiogênico 9. Aqui nós descrevemos o ensaio microbolsa córnea desenvolvida em camundongos. Inicialmente, o modelo foi utilizado para medir a estímulos angiogênicos inespecíficos em córneas de coelhos. Isto foi feito através da introdução de peças tumorais no humor aquoso da câmara anterior do olho de coelho e medido a neovascularização induzida por tumores 11. No entanto, o ensaio foi mais tarde evoluiu para estudar os efeitos de crescimento específico fatores 10 para melhor especificar e padronizar o efeito angiogênico. A fim de libertar o factor de crescimento do olho, peletes de libertação lenta que contêm quantidades conhecidas de factores de crescimento angiogénicos foram usados ​​em vez de tecidos. A disponibilidade de proteínas recombinantes purificadas angiogénicos, tais como VEGF ou bFGF permitiu a sua utilização como alvos específicos de angiogénese modulaters 12. Inicialmente, o ensaio eralargamente utilizado em coelhos, que são mais fáceis de trabalhar devido ao seu tamanho, mas mais tarde o modelo foi traduzido em ratos; um modelo de animais mais pequenos e menos caros. Mudando de coelho para ratos proporcionou uma importante vantagem de ser capaz de usar animais geneticamente manipulados, criando assim uma nova área de pesquisa sobre os componentes genéticos que afetam a angiogênese 13. Além do uso de mais aceitável de ensaio córnea em estudar angiogénese, outros processos biológicos também podem ser investigadas utilizando ensaios modificados. Por exemplo, se tornaram possíveis estudos de lymphangiogenesis através da implantação de baixa dose de pelotas bFGF que permitiu a visualização dos vasos linfáticos por meio de marcadores moleculares específicos 14. Além disso, este ensaio tem fornecido um meio para avaliar os efeitos da radiação na angiogénese 15. Em suma, o ensaio microbolsa angiogênese corneal é uma quantitativa, reproducible, avaliação flexível de angiogênese in vivo. Uma vantagem principal deste ensaio é que a medição dos vasos de fundo é desnecessário, porque os vasos crescem no tecido avascular naturalmente. Descrevemos aqui o protocolo deste ensaio em detalhes e discutir diferentes cenários que podem ocorrer. O ensaio consiste em três segmentos distintos. A seguir, descreveremos a preparação de peletes de crescimento de factores, inclusive, o implante cirúrgico subsequente e, finalmente, o método utilizado para quantificar o crescimento neovascular resultante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

O ensaio microbolsa córnea do rato é um ensaio robusto e quantitativa in vivo para avaliar a angiogénese. A utilização de peletes de libertação lenta padronizadas, contendo factores de crescimento específicos que provocam o crescimento de vasos sanguíneos para a córnea naturalmente avascular, a angiogénese pode ser medida e quantificada. Neste ensaio, a resposta angiogénica é gerada ao longo de vários dias, dependendo do tipo e dose de factor de crescimento utilizado. A indução de neovascularização é normalmente desencadeada por qualquer factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Através da combinação destes factores de crescimento com o sucralfato e hídron (poli-HEMA (poli (metacrilato de 2-hidroxietil))) e lançando-se a mistura em grânulos, que podem ser implantados cirurgicamente no olho do rato. Estes peletes uniformes-se lentamente libertar os factores de crescimento ao longo de cinco ou seis dias (bFGF ou VEGF, respectivamente), que permite a resposta angiogénica suficiente necessário para a área do vaso quantification utilizando uma lâmpada de fenda. Este ensaio pode ser usado para diferentes aplicações, incluindo a avaliação de fármacos moduladores angiogénicos ou tratamentos, bem como a comparação entre diferentes origens genéticas que afectam a angiogénese. Um investigador perito depois de praticar este ensaio pode implantar um sedimento em menos de 5 minutos em cada olho.

Os resultados típicos para bFGF e VEGF nos peletes normais baixos angiogénicos C57BL / 6J são mostrados na Figura 2A e B, respectivamente. Figura 2E mostra a distribuição normal de área do vaso (VA) em C57BL / 6J estirpe com doses variáveis ​​de crescimento esses fatores. 80 ng de bFGF peletes normalmente resultam em um VA de cerca de 2,0 mm 2, apesar de os valores no intervalo de 1,8-2,4 mm 2 são aceitáveis. 200 ng pelotas de VEGF inc...

Watch this Scientific Journal Video about The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye at JoVE.com

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

O protocolo descreve o ensaio de microbolsa corneal conforme desenvolvido em ratinhos.

A córnea microbolsa Ensaio: Um modelo de angiogênese no mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

the-corneal-micropocket-assay-a-model-of-angiogenesis-in-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K visualizações.  Boston Children's Hospital.  O protocolo descreve o ensaio de microbolsa corneal conforme desenvolvido em ratinhos. 

Vídeo: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Neurociência

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento Estudo de Sobrevivência de células da retina Gânglio

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...