Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental [K22ES012264 para AJRB] e um American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloto projectaward [para AJRB]. Agradecemos também aos membros do laboratório de Bishop para a leitura crítica do manuscrito e comentários sobre o vídeo e Adam Brown, em particular, para a exemplo do que não fazer. Agradecemos ao Dr. Donald McEwen de Câncer Greehey infantil Research Institute por nos permitir o uso de seu escopo dissecar / vídeo câmera set-up para as filmagens do vídeo de dissecação. Agradecemos a Daron Brown em Instrumentos Corte para afiar e reparação de nossas ferramentas de microdissecção.

1. Remover o tecido Extraneous do lado de fora do olho <ol><li> Despeje 1X PBS na tampa de um prato de 35 mm. O nível deve ser logo abaixo da borda da tampa. </li><li> Utilizando uma pinça reta, olhos de transferência (s) do tubo de armazenamento para o prato de 35 mm. Olhos estão submersos em PBS, por duas razões: 1. Os tecidos estranhos irá &quot;flutuar&quot; longe dos olhos para que você possa ver e removê-los facilmente, e 2. Durante a dissecção, o olho vai, naturalmente, manter a sua forma esférica, enquanto em suspensão, permitindo que você trabalhe com este formato e não contra ela. </li><li> Utilizando ambas as pinças anguladas (45 ° e 15 °), remova tanto músculo e tecido conjuntivo possível, puxando o tecido contra a corrente (ou seja, em direção à córnea). Alguns tecido conjuntivo permanecerá. Esforço deve ser feito para comprimir o globo ocular o mínimo possível. </li><li> Comércio seus 15 ° para pinças tesouras primavera. Enquanto mantém o olho fixo com 45 pinças °, use a tesoura para cortar mola muscular restantes e do tecido conjuntivo, bem como o nervo óptico. * Dica: Use a borda externa da tesoura para empurrar o tecido de encontro à grão (em direção a divisão córneo-escleral) e depois cortar. Continue até que todo o tecido estranho foi removido do olho. </li></ol> 2. Remova a córnea ea lente <ol><li> Com a córnea para cima, use a pinça de 45 ° a beliscar-se uma pequena dobra no centro da córnea. </li><li> Usando a tesoura primavera, fazer uma pequena incisão na base do retalho. Deixar de ir a retalho. </li><li> Mantendo os olhos ainda com o fórceps, inserir o menor lâmina de tesoura para dentro e perpendiculares à incisão e fazer um corte para a divisão córneo-escleral. Tente manter a sua menor lâmina sob a íris para tanto a córnea ea íris são cortadas. Não corte todo o caminho para a divisão córneo-escleral. Mantenha tesouras inserido no olho. </li><li> Usando o seu fórceps de 45 °, cuidadosamente girar o olho para que sua tesoura são paralelos ao dividir córneo-escleral e fazer um pequeno corte. Girar lentamente os olhos de 360 ​​°, fazendo pequenas incisões em toda a volta. Mais uma vez, tentar manter a parte inferior da lâmina da tesoura sua primavera sob a íris para que ambos íris e córnea são cortados. Levante a íris ea córnea longe do resto do olho e descartá-las. </li><li> Incline o olho do seu lado e pressione suavemente na metade posterior do olho, forçando a lente para fora. Descarte da lente. O interior da ocular restante está alinhada pela retina neural, que deve ser suave e opaca. </li></ol> 3. Trimestre a ocular, resultando, resultando em um 4 - &quot;pétalas&quot;, flor-como a estrutura <ol><li> O olho deve estar posicionado de tal forma que a abertura da ocular é perpendicular ao seu corpo. Use sua pinça de 45 ° a posição firme e ocular o. </li><li> Segurando uma tesoura sua primavera na frente de você assim que são perpendiculares ao seu corpo, insira a parte inferior da lâmina da tesoura sua primavera na borda superior do copo olho aberto. Usando o seu fórceps de 45 °, alinhe cuidadosamente o copo olho para que um corte, única reta pode ser feita a partir da divisão córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico. Todos os cortes devem ser perpendicular à divisão córneo-escleral ea menos que especificado, deve ir tão perto da cabeça do nervo óptico quanto possível, sem cortá-lo. </li><li> Gire a ocular 180 °, mantendo a sua perpendicularidade com o seu corpo. Usar a técnica em passo 3.2 para fazer um corte perpendicular segundo. </li><li> Gire a ocular e repita a técnica descrita em 3.2 para fazer dois cortes mais. Todos os quatro cortes devem ser tão próximas a 90 ° entre si quanto possível. Tenha em mente que o olho não é perfeitamente esférica para que haja alguma variabilidade. </li></ol> 4. Corte cada um dos quatro &quot;pétalas&quot; no meio, resultando em uma estrutura de oito pétalas de flores como <ol><li> Transferência a ocular esquartejado do prato 35 milímetros para uma lâmina limpa. Com a ocular para cima, colher por baixo com as 45 forceps °. Cuidadosamente retire-o do líquido e colocá-lo em uma lâmina limpa. </li><li> Utilizando ambas as pinças anguladas, gentilmente abrir o olho, com a retina neural voltada para cima. NÃO REMOVA A NEURAL RETINA-ajuda o olho manter alguns de seus forma esférica para que você não está trabalhando contra ela. Também protege o RPE de ser acidentalmente danificados nos procedimentos a seguir. </li><li> Gire o slide até que uma das pétalas é perpendicular ao seu corpo. </li><li> Use seus 15 forceps °, agarram delicadamente o canto da pétala. O canto da pétala deve ser córnea, retina neural ou não RPE. Levante o canto suave, permitindo-lhe manter a sua curvatura. </li><li> Insira a lâmina inferior da tesoura sua mola entre a pétala eo slide. Line up suas tesouras de tal forma que uma única linha reta, corte perpendicular pode ser feita a partir da divisão córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico. Corte o mais próximo da cabeça do nervo óptico como withou possívelt cortá-lo. Deixar de ir a pétala, permitindo que ele deitar no slide. </li><li> Girar a lâmina de 90 °, de modo que a pétala seguinte é perpendicular ao seu corpo. Repita o passo 4.5. </li><li> Repita os passos 4.5 e 4.6 mais duas vezes. A estrutura resultante deve ser semelhante a uma flor de oito pétalas. </li></ol> 5. Remova a retina neural <ol><li> Pipeta 100-200 mL de 1X PBS para a amostra. Isso impedirá que a retina neural grude que você retire-a do EPR. </li><li> Tipicamente, a retina neural é vagamente ligado ao RPE. No entanto, ele requer prática e habilidade para remover somente a retina neural e não o RPE. Gentilmente segure uma pétala da retina neural com um par de pinças anguladas estabilizando ao mesmo tempo (mantendo) o resto do olho com o outro par de pinças anguladas. Puxe a retina neural longe do resto do olho. Continue este procedimento até a retina inteiras neural foi removido. * Dica: furar a ponta do seu 15 ° para forceps cabeça do nervo óptico para ancorar o olho. Em seguida, use a pinça de 45 ° para varrer debaixo da retina neural e retire-a e longe. Geralmente é melhor para levantar a retina neural da cabeça do nervo óptico em direção ao dividir córneo-escleral. Certifique-se de afastar quaisquer vestígios da íris frouxa. A íris é muito pegajosa e pode ficar preso de outra forma para o EPR. </li><li> Lavar a amostra com PBS 1X. Pipeta 100-200 mL de 1X PBS para a amostra e chupar-lo de volta. Descartar a PBS. Repita conforme necessário para remover a poeira e detritos. </li></ol> 6. Monte você espécime (s) em um slide <ol><li> Pipeta 80-90 mL de glicerol 90% para um novo slide em uma forma retangular. Use o lado da ponta da pipeta para fazer um esfregaço, mesmo retangular de glicerol. (Este é o procedimento para a montagem de dois RPE em um slide.) </li><li> Insira o antebraço de 15 de fórceps ° sob o espécime. Levante cuidadosamente a amostra para fora do diapositivo de dissecação. </li><li> Abaixe lentamente a amostra para o glicerol. Abanando as pinças como você retirá-los de debaixo do espécime. </li><li> Repita os passos de 6,1-6,3 para o outro espécime. </li><li> Gire o slide para que o lado mais longo é perpendicular ao seu corpo. Segure o vidro da tampa em um ângulo de 45 ° para o slide de forma que ele está tocando o slide. Movê-lo para o esfregaço glicerol até que eles toquem. Manter contato entre a tampa de vidro e deslize, mova lentamente a tampa de vidro longe da mancha, em direção à borda do slide. Alinhe os lados da lâmina ea tampa de vidro de modo que eles são paralelos. Segure os cantos da tampa de vidro entre o polegar eo indicador. </li><li> Pegar o 15 ° em uma pinça a outra mão. Berço da borda (grátis) superior da tampa de vidro na dobra do braço. Muito lentamente, abaixe a tampa de vidro. Quando o contato é feito entre o vidro da tampa e do glicerol, pare e espere que o glicerol para migrar. Repita esse rebaixamento e espera até que as montagens RPE todo são totalmente cobertos. Isso é para evitar o glicerol altamente viscoso de capturar as bolhas de ar. NÃO empurre para baixo a lamela - o glicerol vai apertar debaixo dela, fazendo de adesão muito pobre. </li><li> Com claras unha polonês, pintura em torno do perímetro onde a tampa de vidro e deslize se encontram. </li><li> Coloque o slide em cima de uma prateleira vazia para secar. </li></ol> 7. Resultados representativos: O resultado deste procedimento deve ser uma estrutura que se parece com uma flor e deve ser bastante simétricos. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. RPE montar todo a partir de um rato C67Bl/6J tipo selvagem. RPE de preto ou animais cutia deve ser de cor marrom escuro e deve ter uma superfície lisa. É normal a notar ondulações na topografia das pétalas. A pigmentação em qualquer espécime dar pode ser um pouco variável, devido à densidade variável de pigmentação de ambos RPE ea coróide subjacente. Setas brancas apontam para hipopigmentadas &quot;canais&quot; - isto é normal e é devido à vascularização subjacente do olho. Azul seta aponta para danos físicos aos dois RPE ea coróide subjacente. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. RPE montar todo a partir de um camundongo diluído. Amostras colhidas de animais diluir pode variar de cor de quase transparente para café au lait e qualquer um espécime é como ter variabilidade dentro dela, indicado em círculos negros aqui. Em geral, RPE colhidas de animais mais jovens são mais leves e aqueles colhidos de animais mais velhos são mais escuras. Setas pretas indicam alguns dos vasculatura subjacente, que aparece hipopigmentadas. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Faloidina coloração pode ser usado para detectar danos físicos ao RPE. Coloração faloidina define claramente as membranas celulares, mostrando a forma hexagonal do epitélio. (A) Exemplo de um rato preto. (B) Exemplo de um camundongo diluído. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. A RPE mal dissecados de um camundongo diluído. (A) Os colchetes indicam margens de córnea que são demasiado grandes, que podem causar deformação e / ou dobrar. Dentro do círculo preto você pode ver uma quantidade excessiva de tecido estranho que não tenham sido removidos da parte traseira do olho. Eles são particularmente evidente, porque a amostra é de um animal diluída. A pétala no canto inferior esquerdo é parcialmente dobrada. (B) Esta montagem tem toda a aparência de um cata-vento. Setas pretas indicam alguns dos cortes que foram feitos. Muitos dos cortes, desde desigualdade córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico não estão em conformidade com o diâmetro. (C) setas pretas indicam como os cortes deveriam ter sido feitas, de acordo com o diâmetro ea perpendicular à tangente.

<ol>
	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O RPE é o site da p un ensaio, um ensaio in vivo de homologia dirigido reparação. O ensaio p un tem sido usado para estudar os efeitos dos danos de DNA diferentes 1,2 e sinalização de danos ao DNA e genes de reparo 3,4,5 sobre a freqüência de homologia dirigido reparação. Este ensaio é altamente sensível, detectando uma única célula eventos no RPE 1. Ele também pode detectar diferenças no momento de homologia-dirigi...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

Do epitélio pigmentar da retina (EPR) está no fundo do olho dos mamíferos, logo abaixo da retina neural, que contém os fotorreceptores (cones e bastonetes). O EPR é uma monocamada de células pigmentadas cuboidal e associados estreitamente com a retina neural logo acima dele. Esta associação faz com que o RPE de grande interesse para pesquisadores que estudam doenças da retina. O RPE é também o local de um ensaio in vivo de homologia dirigido reparo do DNA, o ensaio p un. O olho do rato é particularmente difícil de dissecar, devido ao seu pequeno tamanho (cerca de 3,5 milímetro de diâmetro) e sua forma esférica. Este artigo demonstra detalhadamente um procedimento para dissecação do olho, resultando em uma montagem de todo o RPE. Neste procedimento, vamos mostrar como trabalhar com, e não contra, a estrutura esférica do olho. Resumidamente, o tecido conjuntivo, músculo e do nervo óptico são removidos da parte traseira do olho. Então, a córnea eo cristalino são removidos. Em seguida, os cortes são feitos estratégicas que resultam em achatamento significativo do tecido remanescente. Finalmente, a retina neural é suavemente levantado, revelando um RPE intactas, o que ainda está ligado à coróide subjacente e esclera. Esta montagem inteira pode ser usado para executar o ensaio p un ou para avaliação imuno-histoquímica ou imunofluorescência do tecido EPR.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K visualizações.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.

Vídeo: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neurociência

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Isolamento da retina de camundongos e tratamento com metanol para estudar células ganglionares da retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor em destaque: Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...