We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.

1. Concentração de bactérias a partir de grandes volumes de água agrícolas que utilizam MMS <ol><li> Preparação MMS <ol><li> Corte uma seção retangular de 4-ply gaze medindo 40 x 12 cm. </li><li> Dobre o pano ao longo de ambos os eixos para obter um retângulo de 20 x 6 cm. </li><li> Enrole a gaze firmemente ao longo do seu eixo longitudinal de modo a formar uma haste cilíndrica de cerca de 6 cm de altura e 3 cm de diâmetro. </li><li> Autoclave o cotonete gaze em papel alumínio, não autoclave cassete. Descontaminar a cassete por imersão durante 30 minutos em 10% de água sanitária, e desactivar o cloro residual por imersão a cassete durante 15 minutos em um pentahidrato de tiossulfato de sódio (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) de solução (50 mg / L preparadas em água estéril). </li><li> Insira o cotonete na cassete MMS. NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, comece com uma folha de 4-ply de gaze menta 80 x 22 cm, dobre-o para 40 x 11 cm e enrole para formar um cilindro de aproximadamente 11 cm de altura e 6 cm de diâmetro. </li><li> Monte o MMS. </li><li> Anexar tubo de vinil de espigões em ambos os lados do MMS, garantindo a tubagem adere completamente aos espigões, e corrigir tubo na bomba peristáltica. Certifique-se de que a tubagem a montante da bomba peristáltica é de comprimento suficiente para amostragem. </li></ol></li><li> A concentração de bactérias <ol><li> Amostra de pelo menos 10 litros de água agrícola, executando a bomba peristáltica em alta velocidade. </li><li> Após a amostragem for concluída, retirar a entrada da bomba peristáltica a partir da amostra de água e continuar a executar a bomba até que nenhuma água efluente é observado sair do MMS. </li><li> Se um colector é usado para executar várias amostras ao mesmo tempo, recolher o efluente de cada MMS, e quando é 10 L é filtrada através de um único MMS fechar a válvula para que o MMS particulares e continuar a funcionar a bomba. <ol><li> Quando a amostragem is concluído, retire a entrada da bomba peristáltica da água na agricultura, abrir todas as válvulas do colector, e continuar a executar a bomba até que nenhuma água efluente é observado sair do MMS. </li></ol></li></ol></li><li> Quando a concentração tenha sido concluída para todas as mensagens MMS, remova cuidadosamente o tubo de vinil a partir das torneiras MMS e tampar as torneiras em ambos os lados do MMS. MMS bem fechados pode ser armazenado por até 12 horas antes de adicionar mídia de enriquecimento. </li></ol> 2. MMS Enriquecimento e Preparação de Amostras <ol><li> Enriquecimento <ol><li> Soltar a tampa do MMS, e adicionar assepticamente 20 ml de caldo de enriquecimento estéril apropriado. Use um MMS para cada enriquecimento seletivo. Alternativamente, realizar um enriquecimento não selectivo para propagar as três bactérias alvo na mesma amostra. NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, de forma asséptica remover filtro de pano da cassete e coloque em um saco estéril antes de anúncioding 225 ml da mídia enriquecimento adequado. <ol><li> Para o enriquecimento de E. coli, adicionar 20 ml de água de peptona tamponada (BPW) suplementado com 8 mg / L de cloridrato de vancomicina. </li><li> Para o enriquecimento de Salmonella spp., Adicionar 20 ml de BPW suplementado com o suplemento de Salmonella (4 ml / l). </li><li> Para o enriquecimento de L. monocytogenes, adicione 20 ml de VIDAS UP Listeria (LPT) caldo. </li><li> Para enriquecimento não seletivo simultânea para todos os três microrganismos utilizando um único MMS, use caldo preenrichment universal (UPB). </li></ol></li><li> Feche a tampa do MMS para trás com força. Certifique-se de que as torneiras estão bem tampada, para evitar derrames e possível contaminação durante o enriquecimento. </li><li> Incubar as MMS para até 18-24 horas numa incubadora com agitação a 200 rpm. Utilizar 42 ° C durante E. coli e Salmonella spp. enriquecimentos seletivos. Use 30 ° C para L. monocytogenes enriquecimento seletivo, e usar 37 &amp; #176; C para o enriquecimento não-seletivo. </li></ol></li><li> Preparação de Amostras <ol><li> Quando incubação estiver concluída, remova as MMS da incubadora, destampar uma das torneiras, e gentilmente dispensar cerca de 0,5 ml em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, desapertar os MMS e pipeta fora 0,5 ml de enriquecimento durante a noite. NOTA: Se a versão não-descartável da cassete MMS é usado, pipetar 0,5 ml de enriquecimento do saco. </li><li> Para a análise colorimétrica de E. coli de enriquecimento selectivo, ou para a análise dos enriquecimentos não selectivos, sonicar 0,5 ml de enriquecimento a 5 W, 22 kHz, durante 20 segundos usando um sonicador de sonda. </li></ol></li></ol> 3. Preparação e incorporação de substratos colorimétricos em μPADs <ol><li> Prepare μPADs suficientes para cada amostra e alvo testado. Para detectar E. coli preparar CPRG e X-Glic μPADs, por Salmonella spp. detecção preparar μPADs MC, e por L. monocytdetecção ogenes preparar μPADs X-InP. <ol><li> Preparar tampão HEPES [0,1 M de HEPES com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)] para os substratos colorimétricos e ajustar o pH do tampão de acordo com o substrato que vai ser usado: pH 7,5 para a preparação de CPRG ou X-Gluc, pH 9 para MC, e pH 7 para X-InP. </li><li> Preparar soluções stock dos substratos em que o pH ajustado a concentrações de tampão de HEPES de 3 mM (CPRG), 62,5 mM de (X-Gluc), 15 mM de (MC), 100 mM de (X-InP). Proteger as soluções estoque da luz. </li><li> Coloque os μPADs dentro de uma placa de Petri estéril, em seguida, encaixar o microspot μPAD com 24 mL de cada solução de substrato. </li></ol></li></ol> 4. Detecção e Análise de Dados <ol><li> Detecção <ol><li> Adicionar 6 ml da amostra enriquecida para cada microspot μPAD apropriado contido em uma placa de Petri. </li><li> Coloque a tampa de volta na placa de Petri e selá-lo com Parafilm. </li><li> Incubar a amostracom a μPAD a 37 ° C durante até 3 horas para permitir o desenvolvimento da cor e secagem dos microspots. </li></ol></li><li> Exame visual dos resultados <ol><li> Realizar a detecção por simples inspeção visual das mudanças de cor das μPADs. NOTA: Normalmente, fortes reações que produzem mudanças de cor definitivos são esperados com a 18-24 horas de enriquecimento, o que deve evitar a necessidade de mais esclarecimentos e deve ser considerado positivo. </li><li> Determinar a presença de uma E. coli amostra positiva, observando microspots encaixados com a mudança CPRG do amarelo ao vermelho-violeta e microspots encaixados com X-Gluc mudança de incolor a azul-esverdeada. </li><li> Determinar a presença de um L. monocytogenes amostra positiva, observando microspots encaixados com X-InP mudança de incolor a índigo. </li><li> Determinar a presença de uma Salmonella spp. amostra positiva por microspots observando encaixados com MC mudança de colorless ao roxo-lilás. </li></ol></li><li> Software Aided Análise de Dados NOTA: Conduzido para determinar claramente se reacções fracas são positivos ou negativos e permitir uma análise semi-quantitativa dos resultados. <ol><li> Permitir que as μPADs para secar completamente. </li><li> Digitalizar o μPAD usando um scanner plano. </li><li> Use o software ImageJ para processar a imagem. <ol><li> &quot;Abrir&quot; imagem digitalizada para ser analisado em ImageJ localizado na guia &quot;Arquivo&quot; no menu principal (ou pressione &quot;Clt + O&quot;). </li><li> Inverta a imagem selecionando &quot;Inverter&quot;, localizada na aba &quot;Editar&quot; no menu principal (ou pressione &quot;Clt + Shift + I&quot;). </li><li> Use a guia &quot;Analisar&quot; no menu principal e selecione &quot;Definir Medidas ...&quot; para selecionar as medições relatados analisados. </li><li> Certifique-se de que a &quot;intensidade de cinza média&quot;, &quot;Limite de limiar&quot;, e &quot;caixas rótulo de exibição&quot; sãomarcada, e pressione &quot;OK&quot;. Isso define a forma como o software analisa cada área selecionada e como ela relata ele. </li><li> Use a ferramenta &quot;Oval&quot; para desenhar um círculo que define a área que você deseja medir dentro. </li><li> Sob a guia &quot;Analisar&quot;, selecione &quot;Measure&quot;, (ou pressione &quot;Clt + M&quot;). O software irá medir a intensidade cinza médio dentro da área definida e relatá-lo em uma tela pop-up que pode ser copiado e colado para se destacar para análise posterior. NOTA: Para uma análise mais precisa, pelo menos, duas repetições técnicos de cada amostra deve ser realizada. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).</li><li>Bisha, B., P&#233;rez-M&#233;ndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Modified+Moore+swabs+and+continuous+flow+centrifugation+for+concentration+of+Salmonella+and+Escherichia+coli+O157:H7+from+large+volumes+of+water).">Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water).</a> J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).</li><li>Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Moore+swab+optimization+and+validation+in+capturing+E.+coli+O157:H7+and+Salmonella+enterica+in+large+volume+field+samples+of+irrigation+water.">Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water.</a> Food Res Int. 51, 654-662 (2013).</li><li>McEgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Salmonella+spp.+from+large+volumes+of+water+by+modified+Moore+swabs+and+tangential+flow+filtration.">Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration.</a> Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).</li><li>Jokerst, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+paper-based+analytical+device+for+colorimetric+detection+of+select+foodborne+pathogens.">Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens.</a> Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive,+low-volume,+portable+bioassays.">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLASH:+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices.">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).</li><li>Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet-printed+microfluidic+multianalyte+chemical+sensing+paper.">Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper.</a> Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).</li><li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millimeter-scale+contact+printing+of+aqueous+solutions+using+a+stamp+made+out+of+paper+and+tape.">Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape.</a> Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).</li><li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost,+portable+bioassay.">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li><li>Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jokerst+Rapid+detection+of+pathogens+using+paper+devices.">Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices.</a> US patent. , (2012).</li><li>Bisha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T10-06+Colorimetric+paper-based+detection+of+Salmonella+spp.+and+Escherichia+coli+from+artificially+contaminated+irrigation+river+water.">T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water.</a> , (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo descreve um método para a detecção de E. integrado coli, Salmonella spp., e L. monocytogenes em água agrícola. Aqui, a concentração de MMS de bactérias a partir de grandes volumes (10 L) de água na agricultura, é acoplado com o enriquecimento bacteriana, e detecção colorimétrica de bactérias indicativo usando μPADs. O procedimento MMS pode lidar com elevado teor de partículas nas amostras de água enquanto se concentra a bactérias de 10 vezes, é robusta e simpl...

É importante que os agentes de doenças de origem alimentar são detectados rapidamente e de preferência em ambientes baseados em campo, a fim de reduzir a carga de doenças transmitidas por alimentos. As estratégias comuns para detectar bactérias patogênicas transmitidas por alimentos incluem perfis bioquímicos, cultura seletivo e diferencial, isolamento e detecção imunológica e detecção molecular. No entanto, estes métodos são prejudicados pela contaminação esporádica, pequenas amostras testadas, as baixas concentrações muitas vezes das bactérias patogênicas transmitidas por alimentos, requerem longos tempos de processamento e / ou não são aplicáveis ​​para as definições de campo. Além disso, os compostos em diversas matrizes alimentares são inibitórios para aplicações de diagnóstico e detecção. A fim de melhorar a probabilidade de detecção microbiana, os Estados Unidos Food and Drug Administration tem sugerido que o teste da água na agricultura (como água de lavagem e água de irrigação), que quer entrar em contato com uma grande superfície de produtos frescos ou serve como um veículo para pcontaminação roduce é uma alternativa viável para o teste direto de alimentos 1. Mesmo assim, a freqüência baixa patógeno-peso natural, juntamente com o efeito de diluição da amostra de água agrícola representante torna os métodos de preparação de amostras para a concentração do patógeno essencial. Tal método poderia exigir a amostragem de grandes volumes de água (≥ 10 L), adequada patógeno-concentração, e compatibilidade com estratégias de detecção a jusante. Cotonetes Moore Modificados (MMS) são dispositivos de baixo custo, simples e robustos utilizados para concentrar bactérias de grandes volumes (≥ 10 L) de água 2-4. O MMS é composta de uma cassete de plástico cheio com gaze, que serve como um filtro grosseiro para grandes volumes de água bombeados através da caixa, utilizando uma bomba peristáltica. O MMS é um método não-discriminatório de concentração bacteriana (≥ concentração 10 vezes) que captura material particulado orgânico e inorgânico, incluindo microrganismos em li processadoamostras quid. É provável que a excelente eficiência de concentração de microrganismos alvo por o MMS pode ser explicado pelo fato de que os microorganismos devem ser ligados à fracção-argilo ou micro-agregados orgânicos dos sólidos em suspensão 3. O design robusto do MMS permite superar a maioria dos defeitos associados a outros métodos de filtragem para a captura e concentração de bactérias da água, como o entupimento dos filtros, a incapacidade de processar grandes volumes, as amostras de filtro com alta turbidez, e custos elevados. Por estas razões, o FDA está recomendando que da MMS ser incorporados procedimentos oficiais para procedimentos de coleta de amostras ambientais e relacionadas com a produzir 5. Aqui, é descrito um método para a concentração, o enriquecimento, e a detecção de Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes de águas agrícolas. A MMS é usado para concentração de bactériaeria, e também serve como um recipiente para o enriquecimento selectivo de bactérias ou não selectiva. Detecção bacteriana é conseguido bioquimicamente usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPADs) 6. μPADs pode ser fabricado como redes fluídicas ou testes local usando uma variedade de métodos, incluindo fotolitografia, impressão a jato de tinta, estampagem, e cera de impressão 7-11. Exemplos de modelos de fluidos podem ser os padrões de canal dendríticas em que a amostra é depositada no centro e, subsequentemente, os fluxos de reservatórios distais ou padrões de canal único, no qual a amostra ou o substrato são puxados a partir dos reservatórios exteriores do canal, por acção capilar até ao centro 12. Para este protocolo, optou-se por empregar para 7 mm de diâmetro com papel de cera matrizes ponto encaixados com substratos cromogênicos que podem ser processados ​​por enzimas indicativas dos microrganismos testados aqui: Clorofenol vermelho β-D-galactopyranoside (CPRG) e 5 - bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucuronido (X-Gluc)para detecção de β-galactosidase e β-glucuronidase produzidas por E. coli; Caprilato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (magenta caprilato) para a detecção de C8-esterase produzidas por Salmonella spp.; e-5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato de mio-inositol (X-InP) para a detecção específica de fosfatidilinositol-fosfolipase C (PLC-PI) produzida por L. monocytogenes 6. Assim, a presença de uma bactéria em particular pode ser observado visualmente, sem a necessidade de equipamento complexo ou a interpretação de dados. A especificidade e sensibilidade da detecção colorimétrica μPAD à base de enzimas destas bactérias alvo específicas tem sido explorada anteriormente 6. Além disso, a sensibilidade do método de detecção de concentração integrada para estas bactérias alvo foi avaliada por cravação de grandes volumes de água com níveis de microorganismos (dados não publicados e Bisha et al. 13) pré-determinados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agricultural water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Irrigation water, produce wash water, well water, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl tubing</td>
			<td>Wilmar</td>
			<td>BN-CVT1005</td>
			<td>&#160;1/4&#34; inner diameter,&#160; 3/8&#34; outer diameter, available at:&#160; http://www.wilmar.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Moore Swab cartridge&#160;</td>
			<td>Lumiere Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td>11 &#189; cm in length and 4 &#189; cm in width, available at:&#160; http://www.lumierediagnostics.com.&#160; Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>Chesapeake Wiper &#38; Supply, Inc.</td>
			<td>CC90</td>
			<td>Grade #90, 44 &#215; 36 weave, available at:&#160; www.raglady.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Household Bleach</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Sodium hypochlorite concentration approx. 6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulphate 5-hydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Baker Inc</td>
			<td>8100-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold</td>
			<td>Built in-house</td>
			<td></td>
			<td>Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Micron Meters</td>
			<td>RPP1300</td>
			<td>Available at:&#160; http://www.micronmeters.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Disposable, 10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal preenrichment broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>223510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water</td>
			<td>Difco</td>
			<td>218105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella supplement</td>
			<td>Biom&#233;rieux Industry</td>
			<td>42650</td>
			<td>http://www.biomerieux-usa.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDAS UP Listeria (LPT) Broth</td>
			<td>Biom&#233;rieux Industry</td>
			<td>410848</td>
			<td>http://www.biomerieux-usa.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>861987</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Drummond DP-110 used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Excella E25, New Brunswick Scientific used here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160;</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>10 &#956;l, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Barrier, 10 &#956;l, 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 microcentrifuge tubes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>RNase- and DNase- free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td>Q Sonica LLC</td>
			<td>XL-2000 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;PADs</td>
			<td>Avant&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-2-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-glucuronide (X-Gluc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bed scanner</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Xerox USB scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric paper-based detection of escherichia coli, salmonella spp., and listeria monocytogenes from large volumes of agricultural water

Este protocolo descreve a detecção colorimétrica rápida de Escherichia coli, Salmonella spp., E Listeria monocytogenes, a partir de grandes volumes (10 L) de águas agrícolas. Aqui, a água é filtrada através de estéril modificação Moore Cotonetes (MMS), que consistem de um filtro de gaze simples fechado em um cartucho de plástico, para concentrar as bactérias. Após a filtração, enriquecimentos não selectivos ou selectivos para as bactérias alvo são realizadas no MMS. Para a detecção colorimétrica da bactéria alvo, os enriquecimentos são então ensaiadas usando os dispositivos de análise à base de papel (μPADs) incorporados com substratos bactérias indicativos. Cada substrato reage com enzimas bacterianas alvo indicativo, gerando produtos coloridos que podem ser detectados visualmente (detecção qualitativa) na μPAD. Alternativamente, as imagens digitais das μPADs reagiram podem ser gerados com a digitalização comum ou dispositivos fotográficos e analisados ​​usando o software ImageJ, almugido para interpretação mais objetiva e padronizada de resultados. Embora os procedimentos de rastreio bioquímicos são concebidos para identificar os agentes patogénicos bacterianos acima mencionados, em alguns casos, enzimas produzidas por bactérias do fundo ou a degradação dos substratos colorimétricos podem produzir um falso positivo. Portanto, é necessária a confirmação através de um diagnóstico mais discriminatória. No entanto, esta plataforma de concentração e detecção de bactérias é barato, sensível (0,1 CFU limite de detecção / ml), de fácil execução e rápida (concentração, enriquecimento e detecção são realizados dentro de aproximadamente 24 horas), justificando o seu uso como um método de triagem inicial para a qualidade microbiológica da água na agricultura.

Tal como descrito no presente protocolo, a concentração de bactérias que usam o MMS (Figura 1) pode ser realizada dentro de aproximadamente 15-20 min. Os MMS no construídos a partir de acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) em dois componentes separados; uma tampa e um cartucho de ambos com um espigão de montagem integrado no qual uma haste de gaze cilíndrica é inserida (Figura 1A). Os dois componentes são então aparafusado em conjunto, formando o MMS (Figura 1B).</stro...

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Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

colorimetric-paper-based-detection-escherichia-coli-salmonella-spp

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Environment

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

14.3K visualizações.  University of Wyoming. A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.