Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. Síntese de 10 nm Nanopartículas de Ouro (Gold PN) 15 <ol><li> Preparar a solução A: adicionar 2 ml 1% de cloreto de ouro aquosa para 160 ml Milli-Q, ou bidestilada, água. </li><li> Preparar a solução B: adicionar 8 mL de 1% de tri-citrato de sódio x 2 H2O e ácido tânico 160 ul de 1% em 32 ml de Milli-Q, ou duas vezes destilada, água. </li><li> Aquecer a solução A e B a 60 ° C e misturá-los com agitação. Observe a cor azul escuro imediatamente. Observe cor vermelha depois de cerca de 15 min. Em seguida, aquece-se a 95 ° C, mantém-5 min e arrefecer a solução para a TA. </li><li> Adicionar uma gota de suspensão de NP para uma grelha revestida de carbono e deixa-se secar ao ar. Verifique o tamanho e morfologia de NPs por microscopia eletrônica de transmissão. </li></ol> 2. Revestimento de Ouro NPs com BSA e Marcando com Rhodamine N-hidroxisuccinimidilo Ester (NHS) 16 <ol><li> Adicionar 900 ul NPs de ouro para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml, de centrifugação a 15.000 xg durante 30 min. Opnalmente, preparar vários tubos podem ao mesmo tempo. </li><li> Rejeitar o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 900 ul esterilizadas água Milli-Q e adicionar 100 ul de 2 mg / ml de BSA / PBS, mistura-se num Vortex a 800 rpm durante 30 min. </li><li> Para remover o excesso de BSA, centrifugar a preparação a 15.000 xg durante 60 min. </li><li> Desprezar o sobrenadante e re-suspender as NPs de ouro-BSA em 125 mL PBS, adicionar 12,5 mL de 1 M de bicarbonato. </li><li> Imediatamente antes da utilização, preparar uma solução 10 mg / ml de rodamina NHS / DMSO, adicionar 30 ul de solução de rodamina / NHS DMSO a 1 ml da suspensão de ouro-BSA PN. Incubar a reacção durante 2 horas (ou O / N) à temperatura ambiente durante 800 rpm, mistura, evitando a exposição à luz. </li><li> Purificar as NPs de ouro BSA-rodamina através de diálise contra PBS a 4 ºC com 5 alterações no buffer durante o período de 36 - 48 h. </li><li> Para estabilizar NPs, adicionar 10 ul de 200 mg / ml de BSA / PBS em cada 1 ml de NPs de ouro-BSA-rodamina. Para remover a centrífuga livre ou liberado BSA-rodamina, aos 15,000 xg durante 60 min. Ressuspender o sedimento em 2 mg / ml de BSA / PBS, medir a OD 520, e armazenar a 4 ° C, evitando a exposição à luz. </li><li> Diluir os PN 10 vezes com Milli-Q ou água bidestilada, adicionar uma gota sobre uma grelha revestida de carbono, e deixar secar ao ar. Verifique o tamanho e morfologia de NPs por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Nota: Todos os materiais utilizados para a preparação de NP foram esterilizadas e a operação foi conduzida em uma capa de cultura celular ou em um banco ao lado de uma chama. </li></ol> 3. Cultura de células HeLa <ol><li> Células HeLa que expressam permanentemente LAMP1-GFP são cultivadas em DMEM com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO 2. </li><li> Semear as células a uma densidade de 50.000 por cavidade em uma lâmina de câmara de 8 poços (Ibidi) e incubar S / N. </li></ol> 4. Cultura de Bactérias <ol><li> Use Salmonella enterica sorotipo Typhimurium NCTC 12023 wild-type (WT) tensão. Para efeito de comparação, use cepas mutantes Δ ssaV defeituosos no SPI2-T3SS e Δ sifa falta efetoras chave sifa para SIF. Use cepas abrigando plasmídeo pFPV25.1 de expressão constitutiva de GFP reforçada. NOTA: As estirpes bacterianas são rotineiramente cultivadas em caldo de Luria-Bertani (LB) com adição de 50 ug / ml de carbenicilina (WT) e LB com adição de 50 ug / ml de carbenicilina e / ou 50 ug / ml de canamicina (Δ ssaV, Δ sifa ) do necessário para manter os plasmídeos. </li><li> Inocular uma única colônia de bactérias em 3 ml de LB com antibióticos apropriados e crescer O / N a 37 ºC em condições que agitam para aeração, então diluir 1:31 em fresco LB e continuar o crescimento para 3,5 horas. Neste ponto de tempo, as culturas atingem a fase de log tardia e bactérias são altamente invasivo. A &#39;drum rolo&#39; é conveniente para incubar culturas tubo de ensaio com arejamento. </li></ol> 5. A infecção das células HeLa pelaSalmonella e Gold-BSA-Rodamina NPs Pulso perseguição de rotulagem (ver Figura 1 para o esquema) <ol><li> Medida OD600 das bactérias sub-cultivada e dilui-se a OD 600 = 0,2 em 1 ml de PBS (~ 3 x 10 8 ufc / mL), adicionar quantidades apropriadas de bactérias às células HeLa em lâminas de câmaras de 8 poços para atingir uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100. </li><li> Incubar durante 30 minutos na incubadora de células, lava-se 3 vezes com PBS para remover as bactérias não-internalizadas (este ponto de tempo foi definido como 0 horas após a infecção, ou 0 h pi). Adicionar 300 ul de meio de cultura fresco contendo 100 ug / ml de gentamicina e manter durante 1 hr. Em seguida substituir o meio com meio fresco contendo 10 ug / ml de gentamicina durante o resto do tempo de incubação. </li><li> Depois de incubação com meio de cultura contendo 100 ug / ml de gentamicina, durante 1 hora, o meio é substituído por meio de imagiologia (Eagles MEM sem FCS, L-glutamina, bicarbonato de vermelho de fenol e de sódio, com HEPES 30 mM, pH 7,4) containing 10 ug / ml de gentamicina. NPs de ouro-BSA-rodamina são adicionadas a células HeLa para obter uma concentração final de OD 520 = 0,1. NOTA: NPs de ouro-BSA-rodamina também podem ser adicionados a células antes da infecção, ou em vários pontos de tempo pi </li><li> Após 1 hora de incubação, remover o meio, lavar 3 vezes com PBS, e adicionar 300 ul de meio fresco contendo imagiologia FCS a 10% e 10 ug / ml de gentamicina durante o resto do tempo de incubação. NOTA: A duração da incubação pode variar em função da concentração de PN e linhas celulares utilizadas. Para RAW264.7 de macrófagos, observou-se que 30 minutos de incubação com PN a uma concentração de OD 520 = 0,05 permitido interiorização suficiente. </li></ol> 6. Criação de Imagens <ol><li> Usar um sistema de imagiologia confocal, como um laser de varredura confocal (CLSM) ou de disco rotativo (SD) microscópio com uma câmara de ambiente humidificado para imagem de alta resolução a diferentes pontos de tempo. </li><li> Ligue a temperatura control sistema e esperar até que ele é estável. Otimizar as configurações de imagem, como a ampliação, velocidade de digitalização, a resolução, Z-stack etc. Use as configurações de excitação / emissão adequadas para GFP e NPs ouro-BSA-rodamina. Para este protocolo, use uma velocidade de digitalização de 400 Hz, resolução de 512 x 512 pixels e tamanho Z-passo de 0,25 m. Excitar GFP e ouro-BSA-rodamina usando um laser de Ar (488 nm) e um laser de HeNe (543 nm), respectivamente. Incluir uma imagem de campo brilhante (BF) de canal para observar a forma das células. Para outros sistemas de microscopia e condições de infecção, a definição tem que ser ajustado em conformidade. NOTA: Use o mesmo laser Ar como fonte de luz de canal e sinal BF foi detectado com um detector multiplicador foto (PMT). </li><li> No indicada pontos temporais pi, montar as lâminas de câmara de 8 poços contendo células infectadas no palco microscópio e gravar imagens. </li></ol> 7. Análise de Imagens <ol><li> Use microscopia software de análise de imagem (veja <strong&gt; Materiais e Tabela de Equipamentos), para analisar a reforma do sistema de endo-lysosomal por Salmonella intracelular. Abra os dados clicando em &#39;Open&#39; e escolher o arquivo. NOTA: Como alternativa, os pacotes de software de código aberto, como ImageJ ou FIJI pode ser utilizado para a imagem de análises quantitativas. </li><li> Na barra de ferramentas objetos do clique Ultrapasse vista sobre o ícone <img alt="Ícone" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> para adicionar um novo item de superfície. Clique em <img alt="Ícone" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Next). </li><li> Para analisar uma região de interesse (ROI), selecione um segmento de ROI. Em uma área de visualização, uma seção delimitada-retângulo sobreposto na imagem está representando o ROI. Digite os valores no x- correspondente, y, e os campos Z-, ou clique diretamente nas setas no retângulo de visualização para modificar o tamanho ea posição do ROI. Em seguida, clique <img alt="Ícone" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt; (Next). </li><li> Como um canal de origem, selecione o canal 3 (sinal for Gold-BSA-Rhodamine NPS). Verifique a opção suave para configurar a lisura da superfície resultante. Defina um valor manualmente ou aceite o valor gerado automaticamente. Para Threshold, selecione a opção de intensidade absoluta. </li><li> Para o ajuste de limiar, selecione a opção manual e definir um valor. Na área de visualização, uma prévia limiar superfície é exibido em cinza. </li><li> Na guia Classificar Surfaces a superfície resultante pode ser filtrado por vários critérios. Um filtro padrão é &#39;número de voxels&gt; 10&#39;, e outros filtros também podem ser incluídos, clicando em &quot;adicionar&quot;. Se a filtragem não é necessário, em seguida, elimine todos os filtros, clicando no botão excluir. Clique <img alt="Ícone" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Next). </li><li> Para concluir a criação do Surface, clique em/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt; (Finish). Na lista de objetos, agora desmarque a caixa para o Volume item e nova superfície criado é exibido na área de visualização. </li><li> Exportar as estatísticas. Agora, na vista Ultrapassar a cor dos indivíduos, variar de púrpura para vermelho de acordo com a sua área. E a mesa &#39;Números Plot Area&#39; mostra a informação de estatísticas (por exemplo, número de identificação e área de objetos). Exportar todas as estatísticas de superfície 1 para um arquivo do Excel através de um clique <img alt="Ícone" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (Save). </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

O sistema de endo-lisossômico de células de mamíferos controla processos fisiológicos importantes, incluindo a absorção de nutrientes, transdução de sinal mediadas por hormônios masculinos, vigilância imunológica, e apresentação de antígenos 17. Até agora, uma grande variedade de marcadores foram utilizados para a rotulagem das vias de endocitose e estudos de rastreio. Por exemplo, as sondas Lysotracker são sondas fluorescentes acidotropic desenvolvidos pela Molecular Probes (Life Technologies...

Nanopartículas fluorescentes (PN), incluindo NPs metálicas, pontos quânticos, o NPS de polímero, o NPS de sílica, pontos de carbono, etc., têm atraído uma atenção considerável nas últimas décadas 1,2. Em comparação com os corantes orgânicos tradicionais, NPs fluorescentes mostram químicas, propriedades ópticas e mecânicas desejáveis, tais como a potência do sinal forte, a resistência à fotodegradação e elevada biocompatibilidade 3,4. Essas vantagens tornam o método de escolha para a detecção intracelular e imagens de células vivas. Além disso, uma variedade de NPs elétron-densas são visíveis por microscopia eletrônica (ME), facilitando a sua utilização para análise microscópica correlacionada, que permite combinação de células vivas de rastreamento com microscopia de luz (ML) e maior resolução em nível ultra-estrutural com EM 5. Por exemplo, NPs de ouro têm sido desde há muito tempo utilizado de forma eficiente em células como biossensores para o diagnóstico sensível vivo, bem como no domínio da imuno-6 de rotulagem. S recentestudies indicam que nanopartículas de ouro com diferentes tamanhos e formas podem ser facilmente captação por uma grande variedade de linhas de células e transporte de rotina, através da via endossomal, por conseguinte, ter grande potencial de ser aplicada para o transporte intracelular de seguimento da vesícula e do sistema de rotulagem de endo-7,8 lisossomal . Os agentes patogénicos microbianos, tais como Salmonella enterica, Shigella flexneri e histeria monocytogenes, têm desenvolvido diversos mecanismos para invadir as células hospedeiras não fagocíticas 9. Depois de ser internalizado, os agentes patogénicos, quer localizadas no citosol ou sequestrados nos compartimentos ligados à membrana, interage bastante com os seus ambientes de hospedeiro e modulam estes favorecem a sua própria sobrevivência 10. Por exemplo, Salmonella enterica reside e replica dentro de um compartimento phagosomal intracelular denominada -contendo vacúolo Salmonella (SCV) por infecção 11. O SCV amadurecimentotrafega em direção ao aparelho de Golgi, passando por interações contínuas com a via endocítica, e induz a formação de estruturas tubulares extensas, tais como Salmonella filamentos induzidas (SIF), seleção túbulos nexin, Salmonella transportadora secretora induzida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc . 12-14. Estudar como estas bactérias patogênicas manipular vias de células do hospedeiro é essencial para a compreensão de doenças infecciosas. Aqui, NPs de ouro-BSA-rodamina foram utilizados como marcadores de fluido para rotular o sistema celular hospedeiro endo-lisossomal, e o agente patogénico humano gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) foi utilizado como um modelo de bactéria para estudar as interacções entre o agente patogénico com o hospedar via endocítica. NPs de ouro-BSA-rodamina intracelulares em células não infectadas e células infectadas com WT ou estirpes mutantes de Salmonella foram fotografadas por um microscópio de varrimento a laser confocal (CLSM).Então Imaris software foi utilizado para quantificar a distribuição de NPs, indicando que a infecção por Salmonella induzida extremo rearranjo dos endossomas / lisossomas. Seguindo a descrição do presente método, as experiências análogas pode ser concebido para controlar destino a longo prazo das NPs internalizadas e para investigar a influência de várias substâncias exógenas ou factores endógenos na via endocítica de células eucarióticas.

<table><tbody><tr><td>Gold chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>tissue culture treated, sterile</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td>version 7.6</td><td>various configurations available</td></tr></tbody></table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Nanopartículas fluorescentes (PN), com desejável propriedades ópticas e mecânicas química, são ferramentas promissoras para rotular organelas intracelulares. Aqui, apresentamos um método que utiliza ouro-BSA-rodamina NPs para rotular o sistema de endo-lisossômico de células eucarióticas e monitorar manipulações de acolhimento vias celulares pelo patógeno intracelular Salmonella enterica. As NPs foram prontamente internalizado pelas células HeLa e localizadas em endossomos tardios / lisossomos. Infecção por Salmonella induzida rearranjo das vesículas e acúmulo de NPs em estruturas de membrana Salmonella- induzidas. Implantamos o pacote de software Imaris para análises quantitativas de imagens de microscopia confocal. O número de objetos e sua distribuição de tamanho em células não infectadas eram distintas das que estão em células infectados por Salmonella, indicando extremamente remodelação do sistema de endo-lysosomal por WT Salmonella.

NPs de ouro foram gerados por meio de um método bem estabelecido através da redução de ácido cloroáurico por citrato e ácido tânico. Como mostrado na Figura 2A, as NPs de ouro foram sintetizados quase-esféricas com um tamanho de aproximadamente 10 nm. BSA-revestimento e rotulagem rhodamine não influenciou sua morfologia ou tamanho (Figura 2B). Tem sido relatado que NPs de ouro pode ser prontamente retirado pelas várias células de mamífero e term...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Este artigo descreve métodos para a síntese e marcação fluorescente de nanopartículas (PN). As NPs foram aplicados em experiências de pulse-chase para rotular o sistema de endo-lisossomal de células eucarióticas. A manipulação do sistema de endo-lisossomal por actividades do agente patogénico intracelular, Salmonella enterica foram seguidas de imagem de células vivas e quantificada.

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K visualizações.  Universität Osnabrück.  Este artigo descreve métodos para a síntese e marcação fluorescente de nanopartículas (PN). As NPs foram aplicados em experiências de pulse-chase para rotular o sistema de endo-lisossomal de células eucarióticas. A manipulação do sistema de endo-lisossomal por actividades do agente patogénico intracelular, Salmonella enterica foram seguidas de imagem de células vivas e quantificada. 

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Bioquímica

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Imunologia e Infecção

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Neurociência

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biologia

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

Uma Introdução à Endocitose e Exocitose

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

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Biologia Celular

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

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