Agradecemos a equipe e veterinários no Scott &amp; White Hospital Department of Comparative Medicine, Temple, Texas, para os seus conselhos e ajuda inestimável durante o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto para a medicina regenerativa fundos do programa, Scott &amp; White RGP concessão # 90172, NIH 2P40RR017447-07 e NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Agradecemos ao Dr. Suzanne Zeitouni para provas do manuscrito.

NOTA: Este protocolo é projetado para nu (Nu / J) camundongos fêmeas (18-25 g, 6 semanas) adquirido de Jackson Laboratories. Desde linhagens de camundongos variar um pouco em termos de anatomia e taxa de crescimento, aconselhamos que a fabricação de pinos é otimizado para a tensão, sexo e idade dos beneficiários antes da implantação em seres vivos. Se as estirpes são cuidadosamente combinados, o ajuste de interferência entre a cavilha e a cavidade da medula é altamente reprodutível. Procedimentos para a habitação, alimentação e criação de animais em geral estão fora do âmbito deste protocolo, mas todos os ratos foram alojados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição) e as políticas institucionais criados pelo Animal Care e Institucional Use Committee (IACUC) e Departamento de Medicina Comparativa (DCM) com Scott e Hospital White. 1. Fabricação de Pinos <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52368 / 52368fig2highres.jpg&quot; /&gt; Figura 2: montagem Pin. (A) Fotografias da tubulação de aço cirúrgico em várias fases de montagem e de 4 mm de diâmetro corte cilindro de 5 milímetros de espessura folha Gelfoam. (B) após o polimento o pino montado (acima), o cilindro Gelfoam é aparada, posicionada sobre o aço colar (meio), a seguir autoclavadas, resultando em um pino revestido com Gelfoam estéril seco. Isto melhora a fixação das células no local da lesão e mantém a direcção de cura (abaixo). (C) Um fémur excisada equipado com a cavilha medular. (D) Exemplos de conjuntos de pinos em várias espessuras e comprimentos de demonstrar a flexibilidade desta abordagem. (E) μCT reconstrução de um defeito do fémur estabilizado pinos que ilustra a interacção da cavilha medular ao osso trabecular das extremidades proximal e distal do fémur. <ol><li> Cortar um comprimento de 9 mm hipodérmica 22 G tubagem inoxidável, e um comprimento de 3 mm de 19 L utilizando tubagem de um serviço pesado roda de corte de diâmetro de fibra de vidro reforçada 23,8 milímetros equipado com uma ferramenta rotativa. Use um pequeno alicate de ponta fina para imobilizar a tubulação (Figura 2A, acima). Use óculos de proteção adequado e lidar com ferramenta rotativa com cuidado. </li><li> Colocar uma pequena quantidade (aproximadamente 10 ul) de adesivo de cianoacrilato para o meio do eixo 9 mm. Passe o colar 3 milímetros ao longo do eixo 9 milímetros até no centro e torcer para distribuir uniformemente a cola entre o colar e o veio. Medir as dimensões com um par de pinças digitais e comparar com a Figura 1. Deixa-se para definir, pelo menos, 15 h (Figura 2A, centro). </li><li> Utilize um disco impregnado de esmeril 220 grit para remover as rebarbas e cola em excesso. </li><li> Usando a ferramenta rotativa, polir o pino usando um disco de polimento sentia. </li><li> Enxágüe com água deionizada e seco, com comprear sseD. </li><li> Teste de integridade, colocando uma agulha hipodérmica 19 G romba sobre o eixo do pino de impulso e feitos recentemente contra o colar. Certifique-se de que o colar pode resistir a cerca de 25 g de peso. </li><li> Lavar o pino em filtrada estéril salina tamponada com fosfato (Figura 2B, em cima). Certifique-se de que o eixo do pino se encaixa perfeitamente na cavidade medular femoral com o colar contra as bordas do osso corte (Figura 2C). Protótipo várias configurações para os fins específicos do estudo e do destinatário (Figura 2D). Certifique-se de que as extremidades do pino de penetrar dentro do osso trabecular da diáfise de forma a maximizar a fixação e melhorar o ajuste de interferência (Figura 2E). NOTA: Recomenda-se que o ajuste é testado em peças ósseas antes da implantação em camundongos vivos (por exemplo Figura 2C). </li><li> Use a 4 mm de diâmetro de punção-biópsia cortador para cortar um cilindroa partir de uma folha de cinco milímetros de espessura de esponja cirúrgica gelatina. Usar um bisturi para cortar o cilindro de 3 mm de comprimento e passar uma agulha hipodérmica 20 G longo do comprimento do cilindro para gerar um furo (Figura 2A, abaixo). NOTA: Verificou-se que o posicionamento de uma gelatina ou colagénio andaime no local do defeito melhora a retenção de células e induz o crescimento ao longo do eixo longitudinal do osso. </li><li> Passe o cilindro de espuma de gelatina sobre o pino e alinhar com o colar (Figura 2B, centro) e um ciclo de autoclave em seco a 120 ° C a 15 psi. A espuma de gelatina irá secar e escurecer em cor (Figura 2B, abaixo). </li></ol> 2. Técnica Cirúrgica NOTA: O procedimento a seguir é escrito observando todas as orientações definidas pelo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição). Por favor, observe todas as políticas adicionaisdefinido pelo IACUC local e garantir um protocolo uso de animais IACUC-aprovado (ou equivalente) está no local antes de prosseguir com as seguintes seções. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig3highres.jpg" /> Figura 3: Instrumentos cirúrgicos. (A) kit cirúrgico. Micro-broca (1), o corte de roda (2), fio absorvível (3), sutura exterior (4), lâminas de bisturi (5), cabo de bisturi (6), os pinos medulares estéreis embrulhados em papel (7), medidor de profundidade medular feito formulário tubulação hipodérmica (8), uma pinça de nariz fino (9), uma pinça de ratos dentes (10), agulhas de fresagem sem corte (11), motoristas de agulha (12), pequenas hemostats (13), uma tesoura fina (14), elevador periosteal (15), fórceps modificados Kern (16) (b):. modificações necessárias para produzir Kern estilo ósseas-apertos para os ratos. <ol><li> Escolha uma sala de procedimento cirúrgico ou de laboratório, limpo, com uma porta que pode ser fechado e nenhum tráfego de trânsito. Higienizar a surfac trabalho adequadoe com um desinfectante líquido de limpeza à base de quaternário de grau clínico. </li><li> Enquanto o uso de luvas estéreis descartáveis ​​e robe, criou um campo estéril de aproximadamente 60 x 90 cm 2, na superfície de trabalho higienizado com cortinas de pano autoclavada. NOTA: É aconselhável ter um assistente remover a embalagem exterior e apresentar os materiais estéreis à colocação do campo investigador. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento higienizado equipado com um re-circulador de água quente sobre o pano e cubra com cortinas descartáveis ​​estéreis. Aqueça um esterilizador talão a temperatura de funcionamento (250-265 ° C, isto leva até 30 min). </li><li> No campo estéril, providenciar o kit cirúrgico (Figura 3A) para fornecer acesso conveniente a todos os componentes. Além disso, proporcionar algodão gaze estéril (2 x 2 polegadas, 2), estéreis cotonetes, uma bacia de aço estéril (500 ml) contendo solução salina estéril (0,9% w / v) aplicadores, clorexidina e desinfectantes / álcool isopropílico cirúrgico. </li><li> Montar uma pequenaunidade de anestesia de animais ao lado do campo estéril com uma câmara de indução e conjunto de ponta de cone, de acordo com orientação veterinária e manual do usuário. Use oxigênio clínica grau que o fornecimento de gás e isoflurano, USP. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig4highres.jpg" /> Figura 4: O procedimento cirúrgico. (AC) Abordagem e exposição do fêmur. (DE) Elevation e cortes. (FK) Reaming e dimensionamento de canais medulares. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig5highres.jpg" /> Figura 5: O procedimento cirúrgico. (AB) Instalação de pin. (CD) Encerramento. (E) imagem típica de devidamente posicionado pin 24 horas após a cirurgia. <ol start="6"><li> Coloque um mouse na câmara de indução do sistema de anestesia e set a saída de 2 L min -1 de O 2 e a concentração de isoflurano a 3% (v / v). <ol><li> Verifique se o mouse está inconsciente dentro de 1 min; elevar a concentração de 4% (v / v), se necessário. Remover o mouse, coloque no campo estéril com a almofada de aquecimento posicionado abaixo e aplicar o cone do nariz. Transferência de fluir para o cone, e reduzir o isoflurano a 2,5%, aguarde mais 20 seg, e teste para plano cirúrgico adequado, de acordo com a política institucional. Normalmente, a falta de um reflexo dos membros posteriores quando pressiona suavemente é adequado para a determinação anestesia adequada. </li><li> Durante todo o processo, tem um monitor assistente de uma forte respiração regular e coloração rosa das extremidades e região boca para assegurar um nível adequado de oxigenação enquanto inconsciente. Ajuste anestesia, de acordo com a orientação da política veterinária e institucional, se necessário. Aplicar estéril lágrimas artificiais unguento lubrificante (15% (v) v óleo / mineral, 83% v / v) wh (petrolato ite) para os olhos. </li></ol></li><li> Vire o mouse em um lado com a traseira de membros virada para cima em uma nova cortina descartável. Se necessário, retire a pele com um barbeador elétrico ou creme de depilação. Esfregue o local com solução salina estéril e retire a cortina adicional com o excesso de pele. Coloque uma nova cortina fenestrated sobre o mouse de forma a cobrir todas as partes, mas a toda a região posterior do membro (Figura 4A), mas manter a vista da face e da pata para monitorar coloração e respiração. </li><li> Localize as extremidades proximais e distais do fêmur e da incisão na pele por 5-10 mm ao longo do eixo longitudinal (Figura 4B). Separa-se a camada de pele da fáscia com um bisturi # 15, expondo uma abordagem lateral ao fémur através do bíceps femoral e vasto lateral. Localizar onde o septos de satisfazer ambos os músculos (que é uma linha de tecido branco contra a coloração rosa do músculo). Com um bisturi, com cuidado dissecar ao longo da fronteira até intermuscularo fémur é visível (Figura 4B). </li><li> Desenvolver a incisão com um elevador periosteal romba de modo a expor a totalidade da diáfise (Figura 4C). Use o elevador para expor ainda mais os dois terços centrais do fêmur e tomando cuidado para preservar o feixe neurovascular posterior do lado medial (Figura 4D). Raspe suavemente tecidos moles fora do osso com um bisturi, e seque com um Q-tip estéril ou equivalente. </li><li> Localize o centro do fêmur com calipers se necessário, e marca com um bisturi estéril ou marcador, em seguida, marcar 1,5 milímetros proximal e distal do centro. Gentilmente segure o fêmur usando um par de fórceps nariz-finas previamente formado no estilo Kern para evitar a pressão excessiva sobre o osso. NOTA: As dimensões exatas para as modificações são fornecidos na Figura 3B. É aconselhável para testar a pinça sobre um espécime sacrificados antes da utilização para assegurar o osso não irão quebrar sob pressão requeremd para imobilização durante o corte. </li><li> Usando uma broca bem equipado com uma roda de corte fino revestido de diamante-grit (diâmetro x 0,1 mm de largura 8 mm), fazer o primeiro corte com o elevador no local para proteger o tecido abaixo (Figura 4E). Aumentar o fêmur corte para 45 °, enquanto segurando firmemente a extremidade da diáfise, fazer o segundo corte, remoção de um segmento de 3 mm. NOTA: A proteção Rosto é recomendada nesta fase. </li><li> Com o osso imobilizada por meio de fórceps, resma cuidadosamente as cavidades medulares de cada extremidade com uma agulha hipodérmica 23 G romba. Utilizando um pré-fabricados profundidade de calibre feita a partir de um comprimento de 22 L tubagem colocado em tubos de 19 G (Figura 3A, i MET 8), avaliar a profundidade da cavidade medular fresado e garantir que ele é de 3 mm (Figura 4F-K) . Se a cavidade medular resiste a profundidade de calibre 22 G, resma de novo com uma agulha hipodérmica 22 G romba. </li><li> Com cuidado, insira o pino medular na proximal então distal c medularavities para trazer o fêmur de volta ao seu tamanho original e estabelecer uma estável, de 3 mm de folga (Figura 5A, B). Se necessário, aplicar uma pequena quantidade de tensão manual para atingir um bom encaixe de interferência da haste com o osso cortical do fémur. Certifique-se de que o pino encaixa-se perfeitamente nas cavidades medulares de ambos os lados e as extremidades do osso corte estão alinhadas com o colar. Se existe uma diferença, resma, mais uma vez com uma agulha romba 22 G. </li><li> Mude a posição do músculo e tecido periférico sobre o pino e fechar com uma contínua absorvível 5-0 (Figura 5C). Fechar pele incisão com 5-7 praça nó nylon 5-0 e vedação com adesivo cirúrgico (Figura 5D). </li></ol> 3. Os procedimentos pós-operatórios <ol><li> Depois de fechar a incisão na pele, retirar a anestesia, mas permitir O 2 a permanecer fluindo até que o mouse começa a se mover; esta deve levar menos de 1 min. Se o mouse permanece imóvel após 5 min deO 2 a administração, referem-se a políticas institucionais sobre a intervenção veterinária. </li><li> Quando o rato começa a se mover, gentilmente transferi-lo para uma gaiola contendo preferencialmente, roupas de cama autoclavado seco. <ol><li> Coloque um ninho tipo iglu em cada gaiola e o mouse vai recuar para ele, reduzindo o movimento. Verifique se o mouse recupera mobilidade hind-limb 5-10 min após a recuperação da consciência. </li><li> Realizar o monitoramento pós-operatório diariamente, de acordo com as políticas institucionais. Fornecer hidratação gelatinizado e comida no chão da gaiola para os primeiros 5-7 dias e administrar analgesia e acompanhamento pós-operatório, de acordo com as políticas institucionalmente aprovados. NOTA: Nós administrar 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfina 24 com 0,25 ml de solução salina por via subcutânea, duas vezes por dia durante os primeiros três dias e, posteriormente, se o mouse não recuperar utilitário normal. </li></ol></li><li> Após as primeiras 24 horas de recuperação, tocar ao vivo com animais de raios-X de imagem undeanestesia r para visualizar colocação da cavilha (Figura 4E). Se o pino é deslocado, considerar a cirurgia imediata revisão. </li><li> No dia 7 pós-cirurgia, remover suturas sob anestesia e casa em grupos de acordo com as políticas de criação de animais institucional. </li><li> Depois de 2-5 semanas, humanamente eutanásia de animais de acordo com a American Veterinary Medical Association aprovado métodos de eutanásia 25. NOTA: Uma injeção intraperitoneal de produtos comercialmente disponíveis cocktail barbitúrico combinação eutanásia é eficaz e humana, mas as políticas institucionais locais sobre a eutanásia deve ser seguido. </li><li> Dissecar cuidadosamente afastado o hind-limb expondo o fêmur proximal e da pelve do lado medial. Pressione suavemente a articulação para dentro do lado lateral do membro enquanto retirar a cabeça do fêmur do acetábulo (encaixe do quadril) com um bisturi. Corte restante músculo e pele com um bisturi afiado ou micro-tesoura, liberandotoda a pata formar a pélvis. Com um par de fórceps afiada ou tesoura pesados, corte o menor traseira de membros (tíbia / fíbula) aproximadamente 5 mm abaixo da articulação do joelho. NOTA: Recomenda-se que todas as amostras são armazenadas de forma idêntica antes da análise. </li><li> Retire a pele, mas deixe músculo no lugar. Fixar o tecido em 10% de formalina tamponada suplementado com 10 mM de CaCl2 fixador durante 1 semana, seguidas por armazenamento em solução salina tamponada com fosfato suplementada com 10 mM de CaCl2 até 1 mês antes da imagiologia. Realizam a fixação e armazenamento a 4 ° C. Alternativamente, digitalizar espécimes imediatamente, sem fixação. </li></ol> 4. Análise de amostras NOTA: a cicatrização do osso pode ser avaliada por uma grande variedade de metodologias que estão fora do âmbito deste protocolo. O seguinte é um método que nós empregamos com sucesso usando um gerador de imagens espécime microCT (μCT). Recomenda-se que os seguintes parâmetros de are testado inicialmente, em seguida, otimizado para as necessidades específicas do projeto. <ol><li> Enrole espécime em uma fina camada de filme plástico de vedação e posicioná-lo verticalmente na câmara de instrumento. Certifique-se de que o fêmur é perpendicular ao palco amostra durante todo o exame. Defina a varredura com os seguintes parâmetros; Tensão = 29 kV, corrente = 661 mA, energia = 19 W, tamanho do pixel da imagem (mm) = 21,00; Rotação de 360 ​​graus = yes; quadro de média = on (5); etapa de rotação (deg) = 1,00, movimento aleatório = on. Salve as imagens como arquivos JPEG em uma pasta de destino único por scan (eg Figura 6A). NOTA: A verificação deve ser concluída em 57 min. </li><li> Utilizar o software de reconstrução para gerar imagens axiais com base nos seguintes parâmetros; suavização = on (4), a compensação de desalinhamento = on, redução anel artefato = on (5), a correção de endurecimento do feixe (40%), a rotação CS (deg) = 0,00. Definir a saída 2,000-15,000 unidades Hounsfield. Salve as imagens como arquivos JPEGem uma pasta de destino único por digitalização. </li><li> Usando as imagens axiais e software analítico, definir a região de interesse (ROI) definindo primeiro bordas proximal e distal do defeito original. Conseguir isso selecionando as seções que abrangem apenas o colarinho. Como o colar é mais espessa do que a cavilha medular, estas secções são facilmente definidos (Figura 6B, esquerda). Excluir o colar a partir de cálculos por desenhar uma zona de exclusão em torno dela (com uma margem de 100 mm) e transferência de zona a cada uma das seções do ROI (Figura 6B, à direita). NOTA: momentos de inércia polar, reconstruções 3D e cálculos, tais como o volume de osso novo (Figura 6C, D) pode ser facilmente alcançado utilizando o software. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+micro-CT+to+evaluate+cortical+bone+geometry+and+strength+in+nude+rats:+correlation+with+mechanical+testing,+pQCT+and+DXA.">The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA.</a> Bone. 38, 136-144 (2006).</li><li>Hadjiargyrou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+bone+regeneration.+Insight+into+the+molecular+complexity+of+wound+repair.">Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair.</a> J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).</li><li>Clough, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+regeneration+with+osteogenically+enhanced+mesenchymal+stem+cells+and+their+extracellular+matrix+proteins.">Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins.</a> J Bone Miner Res. , (2014).</li><li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+for+age-related+changes+in+fracture+repair.">Cellular basis for age-related changes in fracture repair.</a> J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).</li><li>Jepsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+patterns+of+skeletal+progenitor+cell+differentiation+and+progression+during+endochondral+bone+formation+affects+the+rate+of+fracture+healing.">Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing.</a> J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).</li><li>Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nonobese+diabetic+mice+to+understand+human+type+1+diabetes.">Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).</li><li>Jee, W. S., Yao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+animal+models+of+osteopenia+and+osteoporosis.">Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Relata-se um método simples para gerar um defeito crítico porte estabilizado pinos do fêmur murino usando padrão de laboratório e equipamentos veterinários. Enquanto a montagem dos pinos e do próprio procedimento cirúrgico requer prática, é bem dentro das capacidades de um cientista de pesquisa biomédica bem treinado ou veterinário. O pino é posicionado no canal medular, sem fixação adicional, tornando o procedimento tecnicamente mais viável do que as abordagens mais complica...

Estima-se que metade da população dos EUA experimentar uma fratura por 65 anos de idade 1. Para aqueles pacientes com fraturas tratadas cirurgicamente, 500.000 procedimentos envolvem o uso de um enxerto ósseo 2 e este número deverá aumentar com uma população cada vez mais envelhecida 3 . Embora o osso é um dos poucos órgãos que tem a capacidade de curar completamente sem formação de cicatrizes, existem casos em que o processo falha 3,4. Dependendo das circunstâncias e qualidade do tratamento, 2-30% das fraturas de ossos longos falhar, resultando na não-união 3,5. Embora ainda haja alguma debate para a definição, pseudo-artrose, lesões ósseas críticas porte ou não sindicalizados geralmente se refere a uma lesão que não cicatriza sobre a vida natural do sujeito 6. Para fins experimentais, a sua duração for encurtado para o tempo médio necessário para a cura completa de uma lesão óssea de tamanho médio. Lesões ósseas não-sindicalizados ocorrer numerous razões, mas os principais fatores incluem trauma extremo resultando em uma lacuna crítica porte, infecção, má angiogênese, o uso do tabaco, ou a capacidade osteoregenerative inibido devido a doença ou 7 anos de idade. Mesmo se não uniões são tratados com sucesso, pode custar mais de US $ 60.000 por procedimento, dependendo do tipo de lesão e as abordagens empregadas 8. Nos casos moderados, enxerto ósseo autólogo é empregado. Esta estratégia envolve a recuperação do osso a partir de um local dador e o implante no local da lesão. Enquanto esta abordagem é extremamente eficaz, o volume disponível de osso derivadas de dador é limitada e o procedimento envolve uma cirurgia adicional, que resulta em dor persistente em muitos pacientes 9,10. Além disso, a eficácia do enxerto ósseo autólogo é dependente da saúde do paciente. Substitutos ósseos feitos de materiais sintéticos ou de osso de doador falecido processados ​​estão disponíveis em abundância 11-13, mas eles have limitações significativas, incluindo propriedades fraca adesão da célula hospedeira, reduzida osteocondutividade, e do potencial de rejeição imunológica 14. Há, portanto, uma necessidade urgente de tecnologias de regeneração óssea que são seguros, eficazes e amplamente disponível. A nossa capacidade de melhorar as estratégias de regeneração óssea é extremamente dependente da capacidade de imitar trauma ósseo grave em animais de laboratório, mas a geração e estabilização das lesões ósseas grandes é tecnicamente desafiador. Na maioria dos casos, o trauma grave ossos longos é mimetizado experimentalmente através da criação de um defeito que não irá naturalmente curar. Embora possa variar com as espécies de 15, isto é conseguido por remoção completa de um segmento de osso que é maior do que 1,5 vezes o diâmetro da secção transversal do osso 16. O osso é então estabilizada com um implante de metal para manter a orientação adequada das arestas de fractura e para permitir a mobilidade. Devido ao seu pequeno tamanho e da fragilidade doseus ossos longos, o estabelecimento de tais lesões em camundongos estão além das capacidades da maioria dos grupos de pesquisa. Como tal, os modelos de defeitos dos ossos longos são confinadas a ratos e animais maiores. No entanto, os ratinhos proporcionam vantagens significativas de investigação em que eles podem ser modificados geneticamente e criadas estirpes como o sistema imunitário comprometido que não rejeitam as células e tecidos humanos. Para aplicações baseadas em células humanas, os ratos imunocomprometidos são atraentes para trabalhar com eles, porque são fisiologicamente bem caracterizado, fácil de casa, de baixo custo e facilmente analisados ​​radiologicamente e histologicamente. De suma importância é que os ratos imunocomprometidos não rejeitam as células de diferentes espécies, incluindo os seres humanos. O seu pequeno tamanho também permite o teste de um pequeno número de células ou volumes de andaimes experimentais em aplicações ortopédicas. Vários modelos murinos ortopédicos têm sido relatado que proporcionam vários graus de estabilidade óssea 17,18. Aqueles systems que resultam em níveis muito elevados de estabilidade, como fixadores externos e placas de bloqueio predominantemente curar por ossificação intramembranosa embora a cura endochondral tem sido relatada 19. Em contraste, aqueles que permitem alguma micro e / ou macro-motion, como as que utilizam pinos medulares não corrigidos ou parcialmente fixos, geralmente curar com uma predominância de ossificação 20,21. Retarde ou defeitos não sindicalizados de ossos longos são particularmente difíceis de alcançar em camundongos devido ao nível extra de estabilização necessária. No entanto, há relatos de um número de abordagens, incluindo pinos medulares com hastes bloqueadas, placas de bloqueio e fixadores externos 22. Esses sistemas geralmente funcionam bem, mas dado o seu projeto complicado que pode ser tecnicamente desafiadora para instalar. Por exemplo, Garcia et al. 23, concebeu um sistema de pino de bloqueio elegante para utilização em ratinhos, mas o procedimento envolve incisões em dois locais separadoss e extensa modificação do fémur para acomodar os pinos. Estes procedimentos foram realizados sob um microscópio de dissecação. Descrevemos uma cavilha medular femoral simples, com uma gola central, concebido para impedir o fechamento de um défice de osso, 3 mm e também delinear as extremidades originais do defeito. Enquanto o pino não foi fixado ao próprio osso, dimensionamento preciso do diâmetro de pino e a fresagem dos resultados de cavidades medulares em interferência suficiente para minimizar o movimento de torção (Figura 1). Com cuidadosa seleção de idade inato, gênero e camundongos correspondida-deformação, o resultado é uma alta reprodutibilidade hipertrófica não-uniondefect 22, que pode ser facilmente avaliada radiologicamente. Além disso regiões de interesse podem ser reprodutível definido após computadorizada de micro tomografia (μCT) para a medição de de formação de osso novo e parâmetros histomorfológicos. Os pinos foram protótipo em nosso laboratório usando ferramentas facilmente disponíveis.<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" /> Figura 1: princípio Experimental resumo esquemática do modelo de defeito segmentar.. O centro de segmento de 3 mm 9-10 mm de um fémur murino é excisado cirurgicamente (esquerda). Um, de calibre 19 de tubo de aço cirúrgico 3 milímetros de comprimento é passado sobre um 9, 22 mm de comprimento L do tubo de aço inoxidável e fixado com adesivo no centro exacto (à direita). O pino resultante é encaixada os canais medulares das restantes porções proximais e distais do fémur com a gola 19 G substituindo o segmento de 3 mm de osso (em baixo, ao centro).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Name of Equipment/Material*</td>
			<td style="width:207px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog or model</td>
			<td style="width:179px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pin Assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dremel rotary tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heavy duty cut off wheel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 19G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8LY</td>
			<td>OD 1.07mm, ID 0.889mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 21G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8YQ</td>
			<td>OD 0.82mm, ID 0.635mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 22G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMYLZS</td>
			<td>OD 0.719mm, ID 0.502mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 23G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FN0SY0</td>
			<td>OD 0.643mm, ID 0.444mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emery disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rubber polishing point</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Felt polishing disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin sponge</td>
			<td>Surgifoam/Ethicon</td>
			<td>1974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Punch biopsy cutter</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgery/post-operative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Warm pad and circulator pump</td>
			<td>Stryker/Thermocare</td>
			<td>TP700, TP700C, TPP722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverage quaternary spray</td>
			<td>Steris</td>
			<td>1429-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bead sterilizer</td>
			<td>Germinator/CellPoint Scentific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anesthesia system</td>
			<td>VetEquip Inc</td>
			<td>901806 or 901807/901809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isofluorane anesthetic</td>
			<td>VETone/MWI</td>
			<td>501017, 502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical disinfectant</td>
			<td>Chloraprep/CareFusion</td>
			<td>260449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>various</td>
			<td>recommend German made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Face protection</td>
			<td>Splash Shield</td>
			<td>4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rechargable high speed drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diamond cutting wheel</td>
			<td>Strauss Diaiond</td>
			<td>361.514.080HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbable sutures&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>UM-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Outer sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>668G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydration gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diet gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt and Benckser</td>
			<td>12496-0757-01</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse igloos</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>K3328, 3570,3327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Euthanasia cocktail</td>
			<td>Euthasol/Virbac</td>
			<td>710101</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live animal imager&#160;</td>
			<td>Orthoscan</td>
			<td>FD Pulse</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT unit and software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan1174</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sealing film/Parafilm M</td>
			<td>VWR or Fisher</td>
			<td>100501-338, S37441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple critical-sized femoral defect model in mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Ratos normalmente recuperar a consciência e traseiras-limb mobilidade 5-10 minutos após a retirada da anestesia. Durante os primeiros 5 dias, é aconselhável para abrigar os ratinhos individualmente e introduzir enriquecimento ambiental para evitar a utilização excessiva do membro. Para o efeito, do tipo iglu ninhos reduzir a necessidade de construção de ninhos e incentivar repouso. Observamos, também, que o fornecimento de alimentos e hidrogel no chão da gaiola reduz a probabilidade de pin deslocamento. Durant...

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A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Um Defeito modelo simples Critical porte Femoral em Ratos

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

a-simple-critical-sized-femoral-defect-model-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K visualizações.  Texas A&M Health Science Center. Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice. 