Reconhecemos Julie Heward para ajudar na preparação de hNSCs e Lavaniya Thanabalasundaram pelo apoio técnico com HeLa cultura e transfecção.

1. diferenciação HNSC em Tridimensional Cultura (3D) NOTA: Isolar e derivar hNSCs, a partir de um tecido aprovado ética, descrito na publicação anterior 2. Por favor, siga as diretrizes éticas e institucionais, enquanto seguem este procedimento. 1.1) Cultura 3D Usando de 12 poços <ol><li> Utilizar técnicas assépticas durante todo o procedimento. Em uma cabine de segurança biológica, andaimes re-hidratar por adição de 2 ml / poço de etanol a 70% preparada com água para irrigação (WFIr). Evite tocar nos andaimes dispensando o etanol a 70% para baixo na parede de cada poço. </li><li> Aspirar cuidadosamente o etanol a 70% e lava-se imediatamente os andaimes com 2 ml / poço de DMEM: F12, durante 1 minuto. Repita o procedimento de lavagem duas vezes. Aspirar cuidadosamente o DMEM: F12 após a última lavagem. </li><li> Andaimes do revestimento por adição de 2 ml / poço de laminina (10 ug / ml) em meio DMEM: F12. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidified incubadora durante um mínimo de 2 horas. Lavar a placa com DMEM quente: F12. </li><li> Semente cada andaime com aproximadamente 500.000 hNSCs em um volume de 150 mL de RMM + FG. </li><li> Incubar a placa durante 3 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora humedecida para permitir que as células em resolver os andaimes. </li><li> Adicionar 3,5 ml de RMM para cada cuidado bem tomar para não desalojar as células dos andaimes. </li><li> Incubar a placa durante 7 dias; substituir médio RMM (3,5 ml / poço) após um dia (primeira alimentação) e novamente depois de 2-3 dias a partir da primeira alimentação. </li><li> Após 7 dias, remova o meio e corrigir as células com 4% de paraformaldeído (PFA) para imunocitoquímica (ICC) ou adicionar 500 mL / poço de reagente de lise para extração de RNA total (loja de placas a ≤ -80 ° C ou proceder à extração de RNA total) . </li></ol> 1.2) A medição da Axon Processo Conseqüência <ol><li> Mancha 4% PFA fixa hNSCs diferenciadas de acordo com um protocolo padrão ICC 20 utilizando β3-tubulina (TUBB3) anticorpo primário, detectado com um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo. Núcleos celulares contracorante com Hoechst (1 m). </li><li> Capturar imagens representativas de células coradas β3-tubulina usando um microscópio de fluorescência; salvar imagens como tiff ou jpeg. Medida do processo axônio excrescência usando uma ferramenta de medição de software (por exemplo, Pro-Imagem Plus). </li><li> Abra a imagem, selecione a opção medições na barra de ferramentas e selecione recurso de rastreamento. </li><li> Para iniciar o rastreamento, selecione o ponto de partida no crescimento axonal, clicando no botão do mouse. Seguir ao longo de todo o comprimento do crescimento axonal; clique direito para terminar cada traço. Repetir para medir todos outgrowthswith axónio no campo de visão. </li><li> Expresse medições como pixels ou um (pendente de calibração configurada). Medidas de comprimento exportar para um programa de planilha eletrônica para análise comparativa e estatística da amostra. </li></ol> 2. Mirna Expression Usando um Células-Tronco eCaminhos do desenvolvimento focada Matriz miRNA PCR 2.1) a extração de RNA total miRNA <ol><li> Realizar a extração miRNA em andaimes e amostras crescidas 2D (diferenciado e indiferenciado controle, HNSC). </li><li> Descongelar andaimes, inserido numa placa de 12 poços, se necessário. Juntar o conteúdo de reagente de lise (500 mL) de 2 poços na mesma 1,5 ml tubo Eppendorf, volume final de 1 ml de reagente de lise. Tome o cuidado de deixar o andaime no poço. </li><li> Para celulares peletizada amostras coletadas anteriormente como secas 2D crescido (diferenciadas culturas HNSC 2D e controle indiferenciada) 1 ml de reagente de lise e transferir o conteúdo em 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Homogeneizar cada amostra de teste utilizando uma seringa de 1 ml e um curta de 20 a 25 agulha de calibre. Passar o lisado através da agulha utilizando seringa de 1 mL até 5 vezes até um lisado homogénea é conseguido. </li><li> Adicionar 200 ul de clorofórmio a cada tubo Eppendorf e a tampa firmemente. Tubos invertido e vortex paramisturar o conteúdo. </li><li> Centrifugar cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo homogenato durante 15 min a ≥12,000 x g. </li><li> Transferir a fase aquosa superior de cada amostra (para evitar a transferência de qualquer interfase, líquido de cor-de-rosa) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco contendo 750 ul de etanol a 100%. Misture bem por inversão. </li><li> Pipeta-se 700 ul de cada amostra de teste, incluindo qualquer precipitado, para um mini-coluna em um tubo de recolha de 2 ml. Fechar a tampa e centrifugar a ≥8,000 xg durante cerca de 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo de passagem. Repetir esta etapa utilizando a parte restante da amostra. </li><li> Realizar um resumo DNA para 15 min. </li><li> Adicionar 700 ul ERP buffer para o mini coluna e centrifugar por cerca de 30 segundos a ≥8,000 x g. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Lavar mini-coluna por adição de 500 ul de tampão EPR e centrifugando durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Descartar o fluxo de passagem. Repita wash.Centrifuge em ≥12,000 xg durante 1 min para secar a membrana ainda mais. </li><li> Elui-se o ARN total em um tubo Eppendorf de 1,5 ml por adição de 40 ul de água isenta de RNase para o mini-coluna e centrifugando durante 1 min a ≥8,000 x g. Medir a concentração de ARN total com a ajuda de um espectrofotómetro adequado. </li></ol> 2.2) Preparação de cDNA miARN <ol><li> Prepare a mistura principal transcrição reversa. Cada amostra requer 4 mL de tampão 5x miScript Hispec, 2 l de 10x nucleics mix, 2 ul miScript reverter mix transcriptase. </li><li> Aliquota 8 ul de mistura principal em um tubo de PCR, adicionar o volume necessário de ARN total (250 ng), e adicionar água isenta de RNase para um volume final de 20 ul. </li><li> Incubar durante 60 minutos a 37 ° C.Incubate durante 5 min a 95 ° C para inactivar miScript Transcriptase Reversa mistura. </li><li> Adicionar 200 mL de água livre de RNase para cada reação de 20 ul transcrição reversa, armazenar a -20 ° C, ou prosseguir com o Real-tiPCR me imediatamente. </li></ol> 2.3) Células Estaminais e Desenvolvimento Pathways Focada miRNA PCR Matriz <ol><li> Prepare a mistura de componentes PCR em um tubo de 15 ml, adicionando 1375 mL de 2x SYBR master mix verde, 100 l preparação miRNA cDNA, 275 mL de 10x miScript Universal Primer, e 1000 mL de água RNase-free (volume total de 2.750 l). </li><li> Transferir PCR em uma mistura de componentes de carga do reservatório de PCR. Remova cuidadosamente a placa de 96 poços PCR matriz da embalagem selada. </li><li> Adicionar 25 uL de mistura de PCR componentes para cada uma das cavidades da matriz de PCR, utilizando uma pipeta de 8 canais, ou um pipetador de 12 canais usando apenas 8 dicas. Mudar pontas de pipeta depois de cada passo do ensaio, a fim de evitar a contaminação cruzada entre os poços. </li><li> Selar placa com película adesiva óptica, e centrifuga-se durante 1 min a 1000 xg à temperatura ambiente (15-25 ° C) para remover as bolhas. Inspecione visualmente a placa de baixo para garantir que não haja bolhas de ar nos poços. </li><li> Coloque a placa de 96 poços de PCR de matriz no reciclador em tempo real. </li><li> Programa o reciclador em tempo real de acordo com: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, e 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C definir um único (recolha de dados de fluorescência). </li><li> Exportar os valores Ct para todos os poços para uma planilha do Excel em branco para uso com PCR Matriz de Análise de Dados Template Excel e software baseado na web. NOTA: O software está disponível em <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Análise computacional para miRNA alvo de Previsão e Validação de mRNAs alvo por Reporter plasmídeo Transfection e Ddual ensaio de luciferase. 3.1) Análise computacional para miRNA alvo Prediction <ol><li> Navegar PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, algoritmo disponível on-line para a identificação de miRNA alvo ARNm de predição. </li><li> Clique em &quot;clique aqui para previsão PicTar em vertebrados&quot;. Uma nova página será aberta. </li><li> Na nova página, interface web PicTar, escolha espécies no menu drop-down e inserir miRNA de interesse na caixa de miRNA ID. Clique busca de alvos de um miRNA. </li><li> Observe a lista de mRNAs alvo classificados por pontuação aPicTar. NOTA: PicTar calcula uma pontuação que reflete a probabilidade de que um determinado UTR será orientado pelo miRNA selecionado, e com base na complementaridade das sementes, termodinâmica e uma previsão combinatória para objectivos comuns em conjuntos de co-expressa miRNAs 22. </li><li> Lista de mRNAs alvo Da mesma forma recuperar usando DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, e TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24, alternativa on line disponível algoritmos. </li><li> Compilar um quadro comparativo dos miRNAs baseado em classificação obtida utilizando diferentes ferramentas de software. PicTar classifica por pontuação, DianaLab por Precisão (com base na relação sinal-ruído e uma pontuação de precisão para a avaliação da significância dos resultados previstos), e por TargetScan PCT agregado (com base na complementaridade das sementes, energia livre termodinâmica de ligação, conservação ao longo diferentes espécies), ver Tabela 1. </li></ol> 3.2) A validação de Alvo mRNAs por Reporter plasmídeo Transfection e Dual ensaio de luciferase. NOTA: 3 &#39;UTR repórteres luciferase para a validação de mRNA alvo tem sido descrito anteriormente 25. <ol><li> Transfection <ol><li> Semente células HeLa, a uma densidade de 10 5 células / poço em placa de 24 poços. </li><li> Após 24 h, co-transfectar células HeLa com 1,5 mL de reagente de transfecção e quer 100 ng de plasmídeo NR4A3 UTR 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39;, bem como 20 nM imita miARN (HSA-miR-96-5p para SOX5 3217; UTR, e HSA-miR-7-5p, e HSA-miR-17-5p para NR4A3 UTR 3 &#39;, respectivamente) por poço. </li><li> Poços de controlo Co-transfectar com NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid e fluorochrome marcado siRNAs controlo negativo. A transfecção de poços de controlo com fluorocromo marcado siRNAs de controlo negativo permite a avaliação da eficiência de transfecção e responde por mímica miRNA 3&#39;UTR ligam especificidade. </li></ol></li><li> Medição da dupla luciferase Atividades <ol><li> Meça Firefly e Renilla atividades luciferase 24 horas após a transfecção. Remover o meio de crescimento celular. </li><li> Preparar uma solução de trabalho I por adição de 50 ul de substrato I em 10 ml de Solução I; homogeneizar. Adicionar 300 uL de solução de trabalho de 24 I em cada poço. </li><li> Transfere-se o conteúdo de cada poço 24 em três poços de uma placa branca de 96, 100 ul cada. Espere 10 minutos e medir Firefly luciferase em conjunto luminometer para aquisição de luminescência. </li><li> Prepare solut trabalhandoião II pela adição de 50 ul de substrato II em 10 ml de solução II; homogeneizar. Adicionar 100 uL de solução de trabalho de 96 I em cada poço já contendo 100 uL de solução de trabalho I. </li><li> Espere 10 minutos e medir Renilla luciferase em conjunto luminometer para aquisição de luminescência. Calcula-se a relação da luminescência da luciferase do vaga-lume para a luciferase de Renilla. </li></ol></li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

Todos os autores são funcionários, estoque e / ou detentores de opções de ações em ReNeuron Ltd ou sua empresa-mãe. Este estudo foi apoiado por ReNeuron (RENE.L).

O desenvolvimento de novos ensaios in vitro para avaliar e melhorar a diferenciação de células-tronco sempre apresentou um desafio para a investigação de suas funcionalidades e capacidades terapêuticas. A longo prazo e de fixação estável de hNSCs, necessária para o desenvolvimento de um ensaio em 3D robusto diferenciação in vitro, foi tratada por meio de testes de vários substratos em 3D com características diferentes em termos de materiais e estruturas. Como parte do desenvolvimento do ensaio, também avaliamos concentração semeadura de células ideal e identificou a necessidade de os andaimes para ser laminina revestido. Embora nossos hNSCs pode diferenciar espontaneamente ao 4-OHT e fator de crescimento de remoção, a implementação de um sistema de cultura 3D mostrou uma melhora significativa em sua capacidade de diferenciação medida pelo axônio processo de crescimento quando comparado com hNSCs 2D diferenciado padrão. Para investigar o efeito da difere induzida 3Dntiation na expressão HNSC miRNA foi utilizada uma matriz de PCR. Comparado com o chip de microarray padrão matriz PCR oferece as vantagens de uma quantificação direta e validação de miRNA de interesse. Embora a matriz de PCR é limitado em termos de número total de miARN por matriz, por exemplo, em menos do que 96 aqui, ele pode ser adaptado para incluir especificamente miARNs de interesse, no nosso caso anteriormente reportado no desenvolvimento de células estaminais. A expressão da via focada miRNAs foi perfilado em 3D e 2D hNSCs diferenciados em comparação com hNSCs indiferenciadas. Os miRNAs mais significativamente regulada foram selecionadas e analisadas para avaliar seus mRNAs alvo putativos com o intuito de determinar a sua funcionalidade e interpretação biológica usando algoritmos disponíveis on-line (DIANA Lab, PicTar e TargetScans). Um único miRNA pode reconhecer centenas de alvos e por esta razão nós validado interações miRNA com 3 &#39;UTR mRNAsthat podem ser candidatos apropriados, em umaregulação xonal. NR4A3, um alvo do hsa-miR-7 e miR-17 da família, é um membro da família de receptores nucleares NR4A que, dependendo do seu nível de expressão, estão envolvidos na diferenciação, sobrevivência, apoptose e regulação do axônio do hipocampo orientação 26. Da mesma forma SOX5, uma meta de hsa-miR-96, é relatado para controlar a progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais 27 de comprimento axônio 28, migração, diferenciação pós-migratório, e projeções de neurônios 29. Ambos SOX5 e NR4A3 foram identificados como um ARNm alvo directo de HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17, respectivamente, por ensaios de luciferase repórter duplo. Duplo de luciferase (Firefly e da Renilla) baseia-se em dois genes repórter diferentes no mesmo plasmídeo e oferece um sistema melhorado que permite a normalização para efeitos causados ​​por transfecção subóptima e efeitos citotóxicos em comparação com um único sistema de plasmídeo da luciferase. Como parte do nosso desenvolvimento do ensaio também otimizado nosso conditi transfecçãoons, a fim de obter alta eficiência. O protocolsdescribed aqui podem ser exploradas para otimizar ainda mais e caracterizar in vitro HNSC diferenciação que pode beimplemented protocolos intransplantation para estudos pré-clínicos e futuras aplicações clínicas.

Investigação sobre células estaminais desempenha um papel central na medicina regenerativa, que também abrange as disciplinas de engenharia de tecidos, biologia celular do desenvolvimento, terapias celulares, a terapia gênica e biomateriais (andaimes e matrizes). As células-tronco são importantes tanto no órgão reparação tecidual developmentand; a compreensão de como as células-tronco funcionam é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos baseados em células estaminais uma nova. CTX0E03 é uma célula estaminal neural humana imortalizadas condicionalmente (HNSC) linha clonal, 2 isolado a partir de córtex primeiro trimestre do feto humano. CTX0E03 definiu características de qualidade que são essenciais para bancos de células clínica em boas práticas de fabricação (BPF) 3. HNSCs pode diferenciar-se espontaneamente em neurônios, glia, e oligodendrócitos e ter sido provada a melhorar déficits neurológicos quando transplantadas em um modelo de roedor de 2,4,5 isquemia focal. O CTX0E03 hNSCs estão actualmente em ensaios clínicos para o AVC disabildade (NCT01151124 6 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNAs tem uma média de 22 nucleótidos de comprimento e são comprovados moléculas reguladoras 7, que não codificam proteínas, mas a região não traduzida 3 ligam primordial (3&#39;UTR) de mRNAs, regulando a sua estabilidade e a tradução em proteínas. MiRNAs são relatados para participar na regulação de um número de processos celulares, incluindo o desenvolvimento, proliferação, diferenciação e 8. Vários miARNs têm sido implicados na regulação do destino e especificação de células estaminais neurais 9. Em bidimensional (2D) meio de cultura padrão a complexidade do ambiente in vivo não é coincidente, e, consequentemente, a indução e regulação da diferenciação HNSC não é óptima. In vivo, as células são rodeados por um microambiente três dimensões (3D), constituído por outros células e ligantes extracelulares, incluindo muitostipos de colagénios, laminina, e outras proteínas da matriz (matriz extracelular, ECM). Estudos anteriores relataram que a topografia arquitetônico dos materiais que imitam as Ações e seu fenótipo celular influência da geometria e destino 10-15. Um certo número de suportes 3D disponíveis comercialmente estão disponíveis; utilizou-se um andaime de poliestireno altamente poroso engenharia com uma arquitetura bem definida e uniforme em uma membrana de 200 um de espessura que proporciona um espaço 3D em células que podem invadir e diferenciar 16-18. Relata ensaios de diferenciação 2D e 3D são usados ​​para avaliar a excrescência axonprocess. Além disso, nós descrevemos um método para traçar o perfil do miRNA expressão de uma linha HNSC grau clínico para investigar mais profundamente os efeitos de miRNA em sua diferenciação. Os métodos ilustrados aqui são baseadas em que os anteriormente descritos na 19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

Células-tronco neurais (NCCC) são capazes de auto-renovação e diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos sob microambientes locais específicos. Aqui, apresentamos um conjunto de métodos utilizados para a diferenciação tridimensional (3D) e análise de miRNA de uma célula-tronco neurais (HNSC) linha clonal, atualmente em ensaios clínicos para o AVC deficiência (NCT01151124 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs foram derivadas de um córtex de ética aprovado primeiro trimestre humana fetal e condicionalmente imortalizada usando a integração retroviral de uma única cópia do c-mycER TAM construir. Nós descrevemos como medir processo axônio conseqüência de hNSCs diferenciadas em andaimes 3D e como quantificar mudanças associadas na expressão miRNA usando matriz de PCR. Além disso, somos exemplos de análise computacional com o objetivo de selecionar miRNA possíveis alvos. SOX5 e NR4A3 foram identificados como alvo putativo miRNA adequada de selecionado significativamente sub-regularmiRNAs d no HNSC diferenciado. Validação alvo Mirna foi realizada em SOX5 e NR4A3 3&#39;UTRs por dupla transfecção plasmídeo repórter e ensaio de luciferase dual.

Na Figura 1 é visualizada a investigação e quantificação de diferenciação HNSC em andaimes 3D em comparação com as culturas tradicionais de superfície plana (2D) e expressedas axônio medições processo de crescimento. Na Figura 2 é representedthe fluxo de trabalho e os resultados para a quantificação miRNA usando células-tronco e as vias de desenvolvimento focado matriz miRNA PCR para investigar expressão diferencial de miRNAs em hNSCs diferenciadas em 2D e 3D, em comparação com o controle indiferenciado. Após a análise comparativa entre miRNA hNSCs diferenciadas e indiferenciadas, e análise computacional para predição alvo, SOX5 e NR4A3 (NOR1) foram identificados como mRNAs alvo putativos. Para estudar a interacção directa entre os miARNs e seu local putativo na 3 &#39;UTR do mRNA foram utilizados dois plasmídeos comercialmente disponíveis que contenham quer SOX5 ou sequência 3&#39;UTR NR4A3 inserido a jusante do gene repórter da luciferase de pirilampo, uma<html> nd contendo no mesmo gene de luciferase Renilla plasmídeo de normalização. Os resultados representativos da UTR 3 &#39;de actividade de luciferase a sub-regulação é apresentada na Figura 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Figura 1:. Diferenciação de hNSCs sobre andaimes 3D, e medição de processo axônio es excrescência (A) após coloração ICC padrão para β3-tubulina (verde) e núcleos contrastado com Hoechst (azul) microfotografias representativos foram adquiridos e medição dos processos axônio realizada com o auxílio de um software de análise de imagem. (B) Diagrams relatando a medição do processo axônio excrescência realizada em 2D e 3D hNSCs diferenciados para 1 (1W) ou 3 semanas (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Figura 2:. Fluxo de trabalho esquemático de miRNA profiling em hNSCs diferenciadas RNA total, incluindo os miRNAs, foi extraído a partir de qualquer hNSCs diferenciadas sobre andaimes 3D e culturas padrão 2D, ou controle indiferenciado. 250 ng de RNA total foram retro-transcrito com um método que facilita a conversão selectiva de miARNs maduros em cDNA adequados para quantificação miARN com diferenciação de células humanas e desenvolvimento matriz miScript miARN PCR. A geo-média de SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A e RNU6-2 foi utilizado para a análise de dados com base no método 2 -ΔΔct. Mudanças significativas foram definidas como +/- 1,5 dobrar e regulação para baixo a um stamedida estatisticamente significativa. Os dados foram analisados ​​por meio de software baseado na web disponível em resultados são expressos como uma clustergrama. Modificado a partir da Figura 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Figura 3: Validação da miARN alvo previsto ARNm utilizando um ensaio da luciferase dupla relatório. (A) Esquema representativo de um plasmídeo repórter da luciferase dupla utilizada como uma ferramenta para validar a sequência 3&#39;UTR como um alvo directo de um miARN. (B) micrografia representativa mostrando a eficiência da transfecção. (C) &#160; Sinais, expressos como actividade relativa de luciferase, a partir de 3 humano &amp; #39; genes repórteres UTR ofSOX5 e NR4A3 foi eliminado significativamente para baixo, na presença de HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17 imita miARN respectivamente. Modificado de Figura 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Gene alvo </td><td> Sites de destino / genes encontrados </td><td> Precisão </td><td> Ponto </td><td> Aggregate P CT </td></tr><tr><td> HSA-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6,74 </td> &lt;td&gt; 0,94 </td></tr><tr><td> HSA-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0,72 </td><td> 4.75 </td><td> 0,85 </td></tr><tr><td> HSA-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0,84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> 0,96 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0,17 </td><td> NF </td><td> 0,88 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0,85 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; hsa-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0,9 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0,9 </td><td> 5,38 </td><td> 0,63 + 0,37 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0,97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Lista de miRNA mRNAs previsão alvo. Representante da tabela miRNAs, alvo genes preditivos, e análise de algoritmos (predizerion / pontuação / agregado fornecido usando Diana Lab, PicTar e TargetScan respectivamente). Modificada a partir da Tabela 3 19.

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Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K visualizações.  ReNeuron. With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Vídeo: Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Biologia do Desenvolvimento

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Infecção por vírus Zika do cérebro Fetal humano culta células-tronco neurais para análise de Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...