The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Reino Unido Home Office ea Universidade de Edimburgo Serviços Veterinários. 1. infecção de camundongos por sonda <ol><li> Loja larvas Heligmosomoides polygyrus L3 em água destilada por até seis meses a 4 ° C. </li><li> Antes da utilização, lavar larvas L3 três vezes em água destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (com freio), mas remover todos os 500 ul de água (para evitar larvas L3 perturbador peletizada) e ressuspender o sedimento de cada vez. </li><li> Para a terceira lavagem, adicionar água a um volume exato (normalmente 40 ml) e aspirado de 20 l com uma ponta de corte de 200 mL de alargar a sua abertura. Colocar duas amostras de 20 ul sobre a superfície de um prato de cultura de 60 mm e contar as larvas L3 (geralmente móvel, e melhor visualizado sob 50X de ampliação com um microscópio de dissecção). Ressuspender o sedimento final em água destilada a uma Concentraçãn de 2.000 larvas L3 por ml. </li><li> Para a produção de ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratos oito semanas de idade, com 400 H. polygyrus larvas L3 em 200 mL de água destilada por sonda oral (ratos conter na posição vertical pela nuca do pescoço e passar suavemente a agulha de gavagem romba através da boca e do esófago para o estômago). Agitar bem antes de cada infecção (larvas resolver rapidamente em água) e 200 ul de aspirado numa seringa de 1 ml; utilizar uma agulha de gavagem dedicado com uma extremidade arredondada. Para a infecção experimental de ratos mais jovens (6-8 semanas de idade), ou outras estirpes puras (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC), infectar ratinhos com 200 larvas L3. </li></ol> 2. Propagação e Manutenção de H. polygyrus <ol><li> Coloque carvão no centro de uma grande banheira de plástico e deixe a água fria da torneira a correr sobre ele para um mínimo de 30 min (carvão ativado unwashed é tóxica para as larvas L3). Escorra a água da banheira e coloque o carvão vegetal em two camadas de papel absorvente, deixando-o exposto ao ar ambiente até ficar completamente seca. </li><li> Se forem necessários ovos, raspar fezes primeiro fora do cólon com uma pinça e tesouras (se necessário). Se for necessário um grande número de larvas L3, colocar em ratinhos uma grelha de arame e recolher partículas fecais ao longo de vários dias. </li><li> Misturar as fezes com carvão granulado numa proporção de pelo menos 1: 1, para atingir uma consistência suficiente para amortecer apenas aderir a papel de filtro. Espalhar uma camada fina sobre o centro de algum papel de filtro umedecido em uma placa de Petri e colocar isso em uma caixa úmido (adicione um pouco de toalha de papel úmido e um prato de água) no escuro durante 12-14 dias. </li><li> Remover larvas L3 a partir do dia 7 em diante, e recolhê-las em pelo menos duas ocasiões antes do papel ser descartado. As larvas formar um anel em torno da borda do papel de filtro; levantar o papel de filtro para fora do prato de petri e enxaguar as larvas que estão à esquerda da placa (usando uma pipeta, 5 ml de água estéril por placa) para um tubo de 50 ml. </li><li> Elevadorfora do papel de filtro e colher as larvas restante deixado na placa com água destilada para um tubo de 50 ml. Centrifuga-se a solução efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar as larvas três vezes com água destilada e, em seguida, armazenar a 4 ° C no máximo de 50 ml de água destilada, até ser necessário. NOTA: As larvas permanecem viáveis ​​e infectantes por pelo menos 6 meses. </li></ol> 3. Cobrança de Adulto H. polygyrus Worms <ol><li> Prepare o Aparelho de Baermann modificado com antecedência como mostrado na Figura 1. </li><li> Cull ratinhos 14 dias após a infecção. </li><li> Lavar o abdómen com etanol a 70%. Corte a pele sobre o abdômen e puxar para trás para revelar a parede abdominal anterior. Fazer incisão na linha média para entrar na cavidade peritoneal. </li><li> Remover todo o intestino delgado e grande (a partir de duodeno proximal para distal recto). Colocar num prato de Petri e seco. </li><li> Endireitar o intestino ao longo de todo o seu comprimento; excisar o cólon fezes contendo; colocar isso em um prato separado para ovos preparações posteriores. </li><li> Extirpar o proximais 20 cm de intestino delgado que contém os vermes adultos -identified pela parede relativamente espessa do duodeno e muitas vezes uma aparência vermelho devido aos vermes intra-luminais. Colocar em um (100 mm de diâmetro) caixa de Petri com 5 ml de solução de Hanks, aquecido a 37 ° C (dois espécimes por prato). </li><li> Abra a porção proximal do intestino cheio de verme longitudinalmente com a tesoura (tesoura redondas-ended são os melhores para isso), e raspar para baixo dentro do intestino alinhando com duas lâminas de vidro para remover os vermes. Em seguida, descartar a parede do intestino limpo. </li><li> Dica vermes em pequenos sacos de musselina, grampo fechado e seguro, com clipes de papel ao redor da borda do funil de vidro (Figura 1). </li><li> Preencha funil com solução de Hanks e adicionar cerca de 4 placas de Petri de vermes em cada funil. </li><li> Local aparelho em 37 ° C incubadora durante 1-2 horas, agitando suavemente a meio para desalojardetritos a partir da preparação do intestino que podem ocluir o filtro de musselina. Tome cuidado para evitar o derramamento de detritos fora do saco de musselina - isso fará com que a contaminação da preparação final HES. Os vermes adultos deveria ter migrado lentamente através do pano de musselina e estabeleceu-se na parte inferior do tubo de ensaio de vidro. Retirar cuidadosamente o tubo de ensaio da mangueira de borracha que liga em cima da pia (tendo o cuidado de evitar a perda de vermes neste momento). </li><li> Usando uma pipeta de plástico, transferir os vermes em um tubo de 50 ml e lavar seis vezes com Hanks Solution (permitir vermes de se contentar com a gravidade, ao remover a mídia com um stripette, adicione 40 ml de Hanks Solution e repita cinco vezes). NOTA: cultura verme deve ser mantido estéril a partir deste ponto em diante. <ol><li> Mover para uma câmara de fluxo laminar e lavar mais seis vezes em solução estéril de Hank suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, pronto para a cultura in vitro. </li></ol></li><li> Contar overmes adultos recuperados por tomar duas amostras de 20 l retomado com um corte de ponta amarela de alargar a sua abertura; esperar que aproximadamente 50% da quantidade de larvas inoculadas. </li></ol> 4. Configurando culturas para HES: Preparação Médio, lavagem vermes adultos <ol><li> Embeber os vermes de 3,11 em cerca de 10 ml de RPMI suplementado com 10% de gentamicina durante 20 min, deixando o tubo de repouso em um ângulo para assegurar vermes são totalmente cobertas. </li><li> Executar esta numa câmara de fluxo laminar: lavar novamente seis vezes com a solução de Hanks (suplementado com 5 U / ml de penicilina e 5 ug / ml de estreptomicina). </li><li> Prepare H. media polygrus. </li><li> A manutenção de esterilidade numa capela de fluxo laminar, para 500 ml de RPMI 1640, adicionar 11,1 mL de 45% de glucose (concentração final 1,2% em RPMI1640 contém 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-Estreptomicina (concentração final de 5 U / ml de penicilina, 5 ug / ml de estreptomicina), 5 mL de L-glutamina (concentração final 2 mM), e5 ml de gentamicina (concentração final de 1%). Não adicione FCS. </li><li> Vermes alíquotas em frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 vermes em 15 ml H. polygyrus media por frasco, e coloque na posição vertical em 37 ° C incubadora (5% de CO 2) por 3 semanas. </li></ol> 5. Preparação de HES <ol><li> Recolha HES contendo meio de cultura a partir de culturas em intervalos de não mais do que duas vezes por semana, deixando de lado a primeira coleção após 24 horas de cultura (devido aos altos níveis de contaminação LPS e proteínas do hospedeiro - podem ser processados ​​separadamente ou descartados). Mantenha cada recolha selectiva e claramente marcado com a data e número do lote. Substitua-o por um volume igual de H. polygyrus media em cada ocasião. </li><li> Centrífuga-HES contendo meio a 400 x g durante 5 min. Em seguida, filtrar esterilizar através 0,2 mm filtros de baixa proteína de ligação em tubos de 50 ml. Loja no freezer -20 ° C claramente identificada com data de verme colheita e data de HES collection. </li><li> Após 21 dias de coleta de HES de cultura, descarte worms. </li><li> Piscina 500-1000 ml de HES sobrenadante (geralmente a partir de estoque congelado, e não incluindo a recolha hr primeiro 24) e se concentram sobre um filtro 3000 MWCO no dispositivo de ultrafiltração sob pressão de azoto. NOTA: Tenha muito cuidado para não deixar a corrida filtro seco. <ol><li> Para configurar o dispositivo de filtro, primeiro lave 3 membrana kDa lado do brilhante para baixo num copo de 1 litro com água destilada por 3 x 20 min com agitação. Monte o dispositivo de ultrafiltração, conforme as instruções do fabricante, com membrana de filtro lado brilhante para cima. Em lugar do armário, a 4 ° C e passar 50 ml de água destilada através antes de começar a concentrar HES reunidas. </li><li> Adicionar a cada tubo de HES no dispositivo de filtração, conforme necessário (100-140 mL por dia), até que o volume é concentrada até 2-5 ml. </li></ol></li><li> A fim de remover os contaminantes do meio de cultura contendo HES, adicionar 50 ml de pirogénio-PBS livre para o dispositivo de filtração e, em seguida, concentrar e para baixo a cerca de 2 ml. Repetir este passo duas vezes (150 ml de PBS no total). Transferir HES em um tubo de 15 ml, esterilizar filtro (com um filtro de 0,2 um) numa câmara de fluxo laminar e medir a concentração de proteína usando um espectrofotómetro (E 280 = 10) ou pelo ensaio de Bradford. </li><li> Aliquota, a etiqueta com o número de lote e data, e congelamento a -80 ° C. </li><li> Realizar um ensaio de LAL cromogénico de acordo com os protocolos do fabricante em cada lote de HES antes da utilização. Se os níveis de LPS são maiores do que 1 U LPS por 1 mg de proteína, considere não usar este lote para experimentos in vivo ou em culturas in vitro. </li><li> Processar os HES recolhidos às 24 h separadamente da mesma maneira; ele conterá LPS e algumas proteínas do hospedeiro e, enquanto não é adequado para experiências funcionais, é uma fonte útil de moléculas individuais que podem ser isolados por purificação de afinidade de anticorpo monoclonal. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

O ciclo de vida de H. polygyrus procede de maneira consistente com fiabilidade. Após a ingestão singular ou gavagem oral de larvas L3 no dia 0, começam a formar cistos sob a serosa duodenal por dia 5, progredindo para moults larvais e, em seguida, como vermes adultos emergentes para o lúmen do intestino desde o dia 10, os ovos podem ser vista nas fezes, a partir de dia 14 e granulomas são visíveis na superfície serosa do duodeno a partir do dia 21. O protocolo descrito acima (e resumidos na Figura 6) permite a produção de elevado rendimento de H. polygyrus produtos de excreção e secreção (HES), além de recuperação de confiança de larvas L3 viável para futuras infecções experimentais e de ciclo de vida. Infecção polygyrus H. demonstrou ser protectora em modelos de asma dependentes OVA ou Der p 1 (Casa alérgeno dos ácaros do pó) 14. Além disso, a supressão da inflamação das vias aéreas pode ser transferido com CD4 + CD25 + </sup&gt; células T reguladoras 14 ou CD19 + CD23 hi células B reguladoras 24 de não-sensibilizados, H. polygyrus ratinhos infectados. Em modelos de auto-imunidade, H. polygyrus infecção tem sido mostrado para ser supressiva no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) de esclerose múltipla 9 e supressão pode ser transferido com a utilização de células CD4 + T ou células B CD19 + a partir de ratinhos infectados 24. Heligmosomoides polygyrus produtos de excreção e secreção (HES) modulam a resposta imune do hospedeiro e suprimir a inflamação mediada por Th2 por um número de mecanismos (esboçado na Figura 7), incluindo: a) A inibição da capacidade de resposta à estimulação de células dendríticas 25, b) indução de células T CD4 + Foxp3 + células T reguladoras 18. e c) o bloqueio da produção de IL-33 20. HES tem sido mostrado para ser protectora quando administrada umat sensibilização ou desafio no modelo OVA-alum de asma 19 e também quando administrado por via intranasal com extrato de Alternaria alérgeno 20, através da supressão de início de IL-33 release. Evitar a contaminação LPS de HES é muitas vezes crucial para o sucesso de futuras experiências imunológicas. No protocolo descrito aqui, os passos críticos para atingir este são para garantir que os detritos contidos dentro dos sacos de musselina do aparelho Baermann não entra na preparação HES final (ver 2.10) e deixar de lado solução ES a partir da primeira 24 horas de cultura (ver 5.1). Nos últimos anos, HES foi completamente caracterizado a nível da proteômica com mais de 370 proteínas distintas identificadas 26,27. Além disso, as larvas de ES fase 4 foi submetida a análise proteómica 28. Os trabalhos em curso inclui a caracterização dos principais componentes de glicanos de HES, conhecido por ser fortemente imunogênica 3, e secretada micro-RNComo que são encapsulados em 50-100 vesículas nm ou exossomos (Buck et al., Submetido para publicação). Com o estabelecimento de protocolos reprodutíveis para a recolha de ES a partir deste parasita altamente imunomodulador, e com grande quantidade de dados de proteômica que identificam os componentes moleculares do HES, o palco já está definido para a identificação e teste terapêutico de moléculas individuais de H. polygyrus que podem mediar os efeitos principais sobre o sistema imunitário do hospedeiro.

Heligmosomoides polygyrus é um helminto gastrointestinal murino natural que está intimamente relacionado com altamente prevalentes nematóides parasitos humanos 1. Em contraste com outros modelos de nematóides tais como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus consistentemente estabelece a infecção crônica em camundongos como um resultado direto de múltiplos mecanismos poderosos imunomoduladores que emprega para suprimir a resposta imune do hospedeiro 2. H. polygyrus tem um ciclo de vida direto: larvas L3 infectantes são ingeridos por transmissão FECO-oral (ou administrada por sonda oral no ambiente de laboratório), após o que eles migram para a camada subserosal do duodeno e enquistam antes de voltar para o lúmen intestinal como vermes adultos cerca de oito dias após a infecção inicial. Acasalamento e produção de ovos ocorre no dia 10 e é possível colher vermes adultos para a cultura e recolha de produtos de excreção e secreção de Day 14 em diante 3. H. polygyrus também interage com a microflora comensal, com aumento lactobacilos presentes em camundongos susceptíveis infectados 4-6, e aumento dos níveis de H. polygyrus infecção após a exposição de ratos para Lactobacilli 6. Infecção ativa com H. polygyrus tem demonstrado proteger contra a imunopatologia em diversos modelos animais de autoimunidade 7-10, colite 11,12 alergia e 13-16. Houve, consequentemente, grande interesse no potencial de moléculas de excreção e secreção de este parasita (&quot;HES&quot;) para down-modular patologia in vivo 17,18. De fato, os efeitos protetores são vistos após o tratamento de camundongos com produtos HES 19 através de vias que estão agora a ser identificados 18,20. Aqui nós descrevemos um protocolo para a produção confiável de Heligmosomoides polygyrus e recuperação de seus produtos secretadosque pode ainda ser utilizada para uma série de investigações bioquímicas e imunológicas funcionais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conhecido como Nematospiroides dubius, e também conhecido por alguns como H. bakeri) é um helminto gastrointestinal que emprega vários mecanismos imunomoduladores para estabelecer infecção crônica em camundongos e se assemelha infecções por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus tem sido extensivamente estudado na área de regulação imune derivada-helmíntico e foi encontrado para suprimir potentemente modelos experimentais de autoimunidade e alergia (ambos com infecção activa e produtos secretados isolado). O protocolo descrito no presente documento descreve gestão do H. ciclo de vida polygyrus para uma produção consistente de larvas L3, recuperação de parasitas adultos e coleta de seus produtos de excreção e secreção (HES).

A susceptibilidade à infecção por H. polygyrus é controlada em grande medida pelo fundo genético da estirpe de ratinho (Tabela 1); Camundongos C57BL / 6 e CBA são altamente suscetíveis 21,22. Para a manutenção do ciclo de vida do parasita, o híbrido F1 entre estas duas estirpes foi escolhido pela sua capacidade para suportar carga parasitária muito mais elevadas, sem morbidez (dano epitelial intestinal excessiva) em comparação com as estirpes parentais. Gavagem oral de 400 larvas L3 é usado para manter o ciclo de vida em ratinhos F1 (resultando em fardos de vermes adultos, mostrados na Figura 2), enquanto que uma dose de 200 larvas L3 é geralmente utilizado para experiências em estirpes puras homozigóticas (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC). No entanto, esta dose pode ter de ser reduzida de acordo com os co-factores ambientais que podem diferir entre as instalações de animais, tais como variações na flora intestinal. Os lotes de HES provaram efi reprodutívelcácia em ensaios funcionais e na composição das proteínas; Além disso, quando foram analisados ​​os sobrenadantes de cada semana sucessiva de cultura, até um total de 4 semanas, os perfis de proteínas foram encontrados para ser muito semelhante (Figura 3). Quando a concentração de HES é medida pelo ensaio de Bradford (ver 5.5), o total proteína é geralmente cerca de 1 mg / mL (Figura 4). Um método alternativo de se concentrar HES é com um concentrador centrífugo (por exemplo, 3-kDa membrana de corte Vivaspin), em que as amostras são centrifugadas a até 4.000 g numa centrifugadora de rotor basculante para fora, remoção de sais do tampão e os componentes de baixo peso molecular. Concentração centrífuga é o mais adequado para processamento de volumes pequenos (1-10 ml) e são limitados a um máximo factor de concentração de aproximadamente 30x. Ao coletar HES, prevenção da contaminação é crítica. Para evitar a contaminação com moléculas do hospedeiro, descartamos HES-containing meios de cultura a partir do primeiro de 24 horas após a colheita verme adulto a partir do intestino mouse. Nós também quantificar o nível de contaminação por LPS em cada lote de HES com um ensaio cromogénico de LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS e níveis abaixo desta são consideradas insignificantes 23. Em nossas mãos, a maioria dos lotes de HES são significativamente abaixo deste limite, a concentração média de LPS em HES sendo 0,23 U / g (Figura 5). Os efeitos de LPS em modelos in vivo de patologia (por exemplo, a supressão de respostas asmáticas) requer, pelo menos, 10 ng de LPS 23. Daí a administração in vivo de 5 ug HES de um lote com 100 pg LPS / ug HES vai incluir 500 LPS pg, bem abaixo da concentração eficaz onde LPS se torna um problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Aparelho de Baermann Baerconfiguração Aparelho mann para a coleta de adulto H. polygyrus (como descrito na seção 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: A média de Worm Burden 14 dias após a infecção com 400 L3 Larvas Média verme pesa 14 dias após a infecção com 400 larvas L3. Os pontos de dados mostrados são de 19 rodadas separadas de infecção de camundongos C57BL / 6xCBA. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: Perfis de proteínas de HES de semanas sucessivas em cultura perfil de SDS-PAGE de proteínas de HES recolhidos em semanas sucessivas de cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Quantidade final de HES a partir de 500 ml contendo meio de ES-Rendimento de proteína a partir de HES 11 lotes diferentes derivadas de cerca de 500 ml de sobrenadante da cultura. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: Níveis de contaminação por LPS de HES de contaminação por LPS em 41 lotes de HES medidos pelo ensaio de Limulus ameobocyte. Concentração de LPS Média = 86 U por mg de HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animated esquemática do H. polygyrus Ciclo de Vida Resumo das principais fases do ciclo de vida de sonda oral de larvas L3, através da recuperação de larvas e vermes adultos para isolamento de HES. Figura 7: Animated esquemática do HES e suas funções efeitos imunomoduladores chave de mediadores solúveis e exosomes contidos HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genótipo (e fundo tensão) </td><td> Fenótipo Infecção Primária </td><td> Referência </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Linhagens puras </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 e C57BL / 10 </td><td> Suscetível </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermediário </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Baixa susceptibilidade </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para citocinas ou receptores de citocinas </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Menos suscetível (a); nenhuma mudança na susceptibilidade mas aumentou granulomas (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rp transgénico (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (ratinhos C57BL / 6 ou BALB / c) </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (ratinho BALB / c ou C57BL / 6) </td><td> Altamente resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgénico(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiência de Th2, diminuiu granuloma gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Nenhuma mudança na susceptibilidade </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, aumento da susceptibilidade </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para marcadores de células T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Marginalmente maior fecundidade </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Higher &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para loci imune inata </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 do receptor de interferão (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Fecundidade mais elevada, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Mais resistentes, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: As infecções primárias com H. polygyrus em geneticamente diferentes e gene-targetted linhagens de camundongos.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.1K visualizações.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus. 

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Imunologia e Infecção

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases show Chagas disease up to three decades or later. Autoimmunity and parasite persistence are competing theories to explain the pathogenesis of Chagas disease 1, 2. To separate roles played by parasite persistence and autoimmunity in Chagas disease we inoculate the T. cruzi in the air chamber of fertilized eggs. The mature chicken immune system is a tight biological barrier against T. cruzi and the infection is eradicated upon development of its immune system by the end of the first week of growth 3. The chicks are parasite-free at hatching, but they retain integrated parasite mitochondrial kinetoplast DNA (kDNA) minicircle within their genome that are transferred to their progeny. Documentation of the kDNA minicircle integration in the chicken genome was obtained by a targeted prime TAIL-PCR, Southern hybridizations, cloning, and sequencing 3, 4. The kDNA minicircle integrations rupture open reading frames for transcription and immune system factors, phosphatase (GTPase), adenylate cyclase and phosphorylases (PKC, NF-Kappa B activator, PI-3K) associated with cell physiology, growth, and differentiation 3, 5-7, and other gene functions. Severe myocarditis due to rejection of target heart fibers by effectors cytotoxic lymphocytes is seen in the kDNA mutated chickens, showing an inflammatory cardiomyopathy similar to that seen in human Chagas disease. Notably, heart failure and skeletal muscle weakness are present in adult chickens with kDNA rupture of the dystrophin gene in chromosome 1 8. Similar genotipic alterations are associated with tissue destruction carried out by effectors CD45+, CD8&gamma;&delta;+, CD8&alpha; lymphocytes. Thus this protozoan infection can induce genetically driven autoimmune disease.

The inoculation of Trypanosoma cruzi in fertile eggs prior to incubation renders the parasite kDNA minicircle integration in embryo cells genome. Crossbreeding reveals the vertical transfer of the mutations to progeny. The kDNA integrates into coding regions at several chromosomes and the chickens die with an inflammatory autoimmune heart disease.

Parasite Induzida geneticamente guiadas Doenças Auto-Imunes do Coração Chagas no Modelo de Frango

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

Avaliação das propriedades imunomoduladora de mesenquimais humanas Células-Tronco (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por &quot;Acufection&quot; e sua aplicação à Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Quantificação rápida de blastogénese induzida por Mitogénio em linfócitos T para identificar drogas imunomoduladoras

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...