Este trabalho foi apoiado pelo subsídio do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee em NTU, Leigh Zerboni na Universidade de Stanford e Dr. Peter Hoffmann, da Universidade do Havaí para a leitura do manuscrito, Yun Chien em NTU para assistência técnica, e Dr. Wen-Chi Wei na Agricultura Biotecnologia Centro de pesquisa da Academia Sinica para aconselhamento técnico.

ratinhos fêmea, com 8 - 12 semanas de idade foram usados ​​para este estudo. C57 / BL6 de tipo selvagem (WT) e IL-15 deficientes (IL-15 - / -) foram adquiridos a partir de National Center Animal Laboratory (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, respectivamente. -IL-15 deficientes (IL-15 - / -) e IL-15 dominante (+/- IL-15 e IL-15 + / +) mostrou uma proporção de 1: 3 na segunda geração a partir do cruzamento de heterozigotos de IL-15 +/-. O genótipo de IL-15 - / - ratos foi confirmada por análise de PCR. Camundongos foram mantidos na instalação Specific Pathogen gratuito (SPF) no Laboratório animal Center (LAC), Universidade Nacional de Taiwan (NTU) College of Medicine. Todos os procedimentos animais, incluindo os materiais e métodos anestésicos foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovado pela Taiwan University College Nacional de Medicina e Faculdade de Animal Care Institucional Saúde Pública e Use Committee (IACUC) (Declaração de Aprovação do Protocolo animal 20130225). &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Preparação de agulhas de acupuntura NOTA: agulhas de acupunctura são dispositivos médicos constituídos por uma pega e uma ponta de agulha (Figura 1A). Os diâmetros da agulha de acupuntura variou entre 0,2 mm (36 L) a 0,35 mm (28 G). Nós seleccionar o ponto mais fino do que a agulha, para evitar o dano celular excessivo potencial durante a punção da pele. Existem 4 comprimentos diferentes da agulha de 0,2 mm, sendo 13 mm (0,5 polegada), 25 mm (1,0 pol), de 40 mm (1.5 in) e 50 mm (2,0 in) de comprimento. Um conjunto de agulhas 10 com comprimento de 13 milímetros desde a aderência melhor confortável durante a oscilação da agulha na pele do ratinho C57BL / 6. Os parâmetros podem ser modificados se o método é aplicado à pele de animais maiores ou realizado por pesquisadores com as mãos maiores. <ol><li> Remover agulhas de acupunctura a partir da embalagem estéril, não pirogénico. Colocar as agulhas em um campo estéril. </li><li> Utilizar fita adesiva para ligar rotulagem 10 agulhas em conjunto ifeixe na (Figura 1B). NOTA: As agulhas 10 são geometricamente dispostos de modo a formar uma forma de cilindro. Por conveniência, utilizar uma peça de película de parafina para estabilizar o arranjo antes de aplicar a fita adesiva. Certifique-se de todos os pontos de agulha estão no mesmo plano. Usando um pacote, em vez de uma única agulha facilita infusão ADN máxima, aumentando a área de contacto entre as agulhas e a pele. </li></ol> 2. Preparação de uma quantidade grande e livre de Endotoxina O DNA de plasmídeo <ol><li> Transformar células bacterianas quimicamente competentes com o plasmídeo de ADN. </li><li> Seleccionar e inocular uma única colónia bacteriana em 3 ml de meio LB contendo antibióticos e incubar a 37 ° C num agitador durante a noite. </li><li> Dimensionar-se a cultura por diluição da cultura bacteriana em 1: 100 em 250 ml de meio LB com antibióticos e agitando durante a noite a 37 ° C. </li><li> Prepara-se uma grande quantidade de ADN, utilizando um elevado Qy, kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxina seguindo as instruções do fabricante. NOTA: protocolo Acufection exige elevado grau de pureza e uma grande quantidade de DNA de plasmídeo. Uso de uma alta qualidade, endotoxina livre e o DNA de plasmídeo purificado em coluna é recomendado. </li><li> Elui-se o ADN em água estéril. ADN loja em pequenas alíquotas a -20 ° C até estar pronto para acufection. NOTA: Evite repetidos de congelamento e descongelamento de DNA para garantir a expressão de DNA plasmídeo consistente. </li><li> Dilui-se DNA de plasmídeo a 1 mg / ml em PBS estéril para acufection. </li></ol> 3. Procedimento para Acufection NOTA: A quantidade óptima de ADN e a área da superfície da pele o alvo pode variar para diferentes genes e precisam de ser ainda mais optimizado. A força de perfurao e o número de vezes para soltar a camada córnea da pele também pode variar dependendo da espessura da pele. Estas condições devem ser cuidadosamente determinada depois de avaliar o nível de gene transcri acufected expressãopts por qRT-PCR. <ol><li> Pesar os ratinhos e administrar tribromoetanol (400 ug por g de peso corporal) por injecção peritoneal. NOTA: 2,2,2-tribromoetanol é um agente anestésico injectável que foi utilizada em ratinhos. As soluções são preparadas por dissolução de um grau não-farmacêuticos 2,2,2-tribromoetanol (2,5 g) em água destilada (200 ml) contendo 2,5% de 2-metil-2-butanol. </li><li> Use vet oftalmológico pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. NOTA: O efeito anestésico vai ser induzida em 1-2 min. Verifique o aperto reflexo dedo do pé para garantir profundidade suficiente de anestesia antes da operação. </li><li> Raspar a pele do flanco dorsal e aplica o creme depilatório para dissolver proteínas de queratina na haste do cabelo. NOTA: O uso de creme depilatório para remover o cabelo vai facilitar a infusão de DNA na pele. </li><li> Use bolas de algodão embebidas em água para limpar o creme depilatório. NOTA: O creme depilatório é solúvel em água. A remoção completa do wil cremel evitar uma superfície gordurosa e garantir um resultado melhor picada. </li><li> Usar uma mecha de algodão estéril embebido em etanol a 70% para desinfectar a superfície da pele. </li><li> Mark área alvo (1 centímetro x 1 cm) sobre a pele depilada com uma matriz pré-medido. NOTA: Marcando o site de destino ajudará a aplicar o pacote agulha para cima e para baixo dentro de uma área definida. Isto é importante para assegurar a entrega da mesma quantidade de ADN para uma área de superfície específica para minimizar a variação da experiência-a-experimento. </li><li> Colocar uma gota de 10 ul de ADN de plasmídeo (10 ug) sobre a pele marcada. NOTA: A quantidade de ADN para acufection varia com diferentes genes e o tipo de vector de expressão. A quantidade de ADN utilizado deve ser cuidadosamente ajustado antes de realizar a experiência de interesse. A 10 uL é uma pequena gota de líquido e situa-se bem sobre a pele raspada e depiladas sem rolar para baixo enquanto picar. Incluem um grupo de controlo de ratinhos tratados com 10 uL de ADN vector vazio para comparar com ratinhos umacufected com o gene estudo. </li><li> Segurar o feixe de agulhas de acupuntura (Figura 1B) e picar a superfície marcada com um movimento para cima e para baixo para 100 vezes ou até que a humidade a partir do ADN em PBS na pele desaparece. NOTA: Alguns vermelhidão da superfície da pele podem ocorrer. Evite fazer cortes profundos que sangram. O número de cima e para baixo da punção movimentos sobre a superfície da pele está operativamente determinada quando a humidade a partir do ADN em PBS (10 mL) desaparece na pele. Decidimos 100 vezes em 30 s, porque ele tem dado os resultados mais consistentes de genes entregou-acufection. Se for o caso, as agulhas podem ser reutilizados para até 6 picadas na pele-alvo (1 cm x 1 cm cada). Lavam-se as agulhas em etanol a 70% e PBS entre acufection. Mudar para novas agulhas quando eles são opaca ou por DNA de plasmídeo diferente a fim de evitar a contaminação cruzada. </li><li> Coloque ratinhos acufected sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo até acordado. </li><li> Voltar ratos para sua gaiola quando eles têmconsciência suficiente recuperou. Nota: Observar ratinhos acufected em gaiola separada (menos de 5 animais por gaiola) da gaiola de ratinhos acufected-un. </li><li> Coloque a garrafa de água no lugar e voltar a gaiola para o IVC (gaiola ventilado individualmente) rack. </li></ol> Cuidados 4. Pós-operatório <ol><li> Durante as primeiras 48 h após o procedimento, ratos acompanhar de perto para qualquer desconforto incluindo alterações comportamentais (agitação, agitação ou eating disorder) ou aparência anormal (pelagem áspera ou postura arqueada). </li></ol> 5. Imiquimod (IMQ) Tratamento de Pele de IL-15ΔE7-acufected NOTA: expressão transcricional e produção de proteína do gene acufected são detectáveis ​​no dia 3. Os ratinhos acufected com o plasmídeo de interesse podem ser tratadas com diferentes tipos de estimulantes 3 dias após a transfecção. Nós ilustramos aqui tratando a pele IL-15ΔE7-acufected rato com creme IMQ. IMQ é um f imidazoquinolin amina aprovadoou o tratamento de verrugas genitais externas e perinatais 13. Tratamento IMQ tópica é mostrado para induzir doenças de pele com psoríase de tipo humano em ratinhos com a manifestação de pele escamosa, proliferação epidérmica e infiltração 12, 14, 15 de neutrófilos dérmica. NOTA: O vector plasmídeo continha-rato de comprimento completo de ADNc de IL-15, sob a regulação do factor de alongamento 1 α (PEF), flanqueado com um péptido sinal de IL-2 e uma etiqueta FLAG no terminal C (pEF-IL 15, 5859 pares de bases), que foi construído como descrito por Bamford et al. 16. O plasmídeo é utilizado como um modelo de IL-15 para eliminar os primeiros 16 aminoácidos nos resíduos 33-48 do exão 7 do gene da IL-15 para IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 pares de bases) por SOE (síntese por extensão de sobreposição) método de PCR de 17. colônias de bactérias que estavam com sucessotransformada com IL-15ΔE7 foram verificadas por digestão com enzimas de restrição e sequenciação de ADN, seguido por 12, 18. Uma grande quantidade de DNA de plasmídeo isento de endotoxina foi preparado como descrito no passo 2 do protocolo. <ol><li> Anestesiar ratos acufected por injecção intraperitoneal de tribromoetanol (400 ug por g de peso corporal) e aplicar veterinário pomada oftalmológica em olhos para evitar a secura sob anestesia. Verifique o aperto reflexo de igual para assegurar profundidade suficiente de anestesia antes do início dos procedimentos operatórios. Observação: Uma vez que a pele de 2 cm x 2 cm de vão ser tratados para IMQ, 2 doses de pIL-15ΔE7 plasmídeo de ADN (10? G em 10? L de PBS por dose) é acufected em 2 locais-alvo (1 cm x 1 cm cada). </li><li> Mark flanquear pele (2 cm x 2 cm), cobrindo a área acufected. </li><li> Use aplicador Q-tip para aplicar topicamente creme IMQ sobre a área de superfície marcada. Nota: passo 5.1 só é levada a cabo durante a primeira dose (60 mg / dose).As doses seguintes consecutivos são aplicados aos ratos não-anestesiados. </li><li> Documentar as alterações de pele dorsal-tratada IMQ diariamente com uma câmara de vídeo de alta definição. Nota: Uma pessoa segura o mouse enquanto outro está gravando. As imagens estáticas são filmados e editados em um momento posterior. </li><li> Eutanásia ratos por injecção de uma overdose de tribromoetanol (800 ug por g de peso corporal) seguida por deslocamento cervical no dia 4 ou dia 7 após o tratamento IMQ. A pele é retirado e processados ​​(Passos 4,1-4,5). </li></ol> 6. homogeneizado rato Pele <ol><li> Use um par de tesouras cirúrgicas para fazer um corte horizontal da base da cauda. Proceder bilateralmente para a base do membro posterior e continuar a cortar verticalmente ao longo do flanco para a base do membro anterior. </li><li> Cuidadosamente tirar a pele a partir do tecido subjacente de posterior para o anterior. Use a tesoura para cortar a pele dorsal. Coloque a pele em uma placa de Petri estéril. </li><li> Use um bisturi para extirpar-alvopele e congelá-lo em azoto líquido imediatamente. Nota: O mesmo tamanho de pele sem acufected (1 cm x 1 cm) ou com tratamento IMQ (2 cm x 2 cm) é fixada para cada rato para minimizar variações experimento-a-experimento. </li><li> Colocar o tecido de pele congelado no centro de uma argamassa de compartimento 2 pré-refrigerada com alças e um pilão. Use um martelo de chumbo na argamassa para pulverizar o tecido. </li><li> coloque rapidamente o tecido pulverizado para um novo tubo contendo 500 ul de reagente de lise de células para a extracção de RNA ou a um tubo contendo 50 uL de PBS e 1x cocktail inibidor de protease para obter lisado de proteína. </li></ol> 7. H &amp; E e imuno-histoquímica Coloração de Secção de pele <ol><li> Colocar o tecido da pele de uma cassete e mergulhá-lo em paraformaldeído a 4% durante a noite. </li><li> Incorporar e seco de tecido, que, no nosso caso, foi realizada pelo Laboratório de Patologia no LAC, NTU. Nota: A secção é cortada a uma espessura de 5? M. seç tecido lugarons em linas carregadas positivamente. </li><li> Aquecer as lâminas a 65 ° C durante 15 min. </li><li> Colocar as lâminas em um suporte de coloração. Imergir a cremalheira para dentro do tanque correspondente contendo substituto de xileno durante 5 minutos duas vezes, seguido por imersão sequencial em 100%, 95%, 80%, 75%, 60% e 50% de etanol (5 min cada) para re-hidratação. Mergulhar as lâminas em água da torneira durante 3 min antes da coloração. </li><li> Execute hematoxilina e eosina. Nota: H &amp; E mancha foi realizado a pedido no Laboratório de Patologia no LAC, NTU. </li><li> Para coloração imuno-histoquímica, bloquear a secção com uma solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 5 min para reduzir a colorao de fundo n especica. Nota: A solução de bloqueio é comercialmente desenvolvidas com técnicas de imunocoloração. Nenhum soro animal é contido neste produto. </li><li> Dip slide em PBS para lavar a solução de bloqueio. </li><li> Dilui-se a solução bloco em PBS a 1:10 e adiciona soro fetal de bovino a 2% (FBS) (solução diluente). </li><li&gt; Pipeta o anticorpo primário diluído apropriadamente para a secção e incubar durante 60 min à temperatura ambiente. Nota: Os anticorpos são diluídos em solução diluente. As concentrações de anticorpos para esta coloração foram optimizados em 1: 800 e 1: 200 para Ki-67 (clone SolA15) e Ly6G (clone 1A8), respectivamente. Estas concentrações são encontrados para mostrar mancha distinta, sem coloração de fundo. <ol><li> Corar uma secção de série no mesmo ensaio com a mesma solução omitindo o anticorpo primário para controlar a ligação não específica do anticorpo secundário. </li></ol></li><li> Lave as lâminas três vezes em TBS mais 0,1% de Tween-20 (solução de TBST) durante 5 minutos cada. Mudança solução entre as lavagens. </li><li> Pipetar uma gota de polímeros marcados para cada secção e incubar à temperatura ambiente durante 40 min. Nota: O polímero marcado está comercialmente preparada por combinação de polímeros de aminoácidos com peroxidase e anticorpo secundário o qual é reduzido a um fragmento Fab&#39;. O reagente está pronto a ser usado paracoloração imuno-histoquímica de secções de tecido de ratinho. </li><li> Lave as lâminas três vezes em TBST, durante 5 minutos cada. Mudança solução entre as lavagens. </li><li> Pipeta 3,3&#39;-diaminobenzindine tetracloridrato solução (DAB) na seco de tecido e deixe repousar à temperatura ambiente até que um precipitado castanho é visível sob um microscópio de campo brilhante. Nota: O tempo para DAB para precipitar na presença de peroxidase é de cerca de 30 min. </li><li> Imergir as lâminas em água para parar a atividade da peroxidase. Dip slides em solução verde de metilo para coloração nuclear. Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada. </li><li> Coloque uma lamela sobre a secção corada que é coberta com meio de montagem permanente (8 mL por secção). </li></ol> 8. Foto e análise do tecido Seção manchado <ol><li> Visualizar secções de tecidos coradas H &amp; E e IHC sob um microscópio de campo brilhante. As imagens de captura usando dispositivo de acoplamento da câmara de carga (CCD) ligado ao microscópio. para qanálise quantitativas, software de imagem pode ser usado <ol><li> Digitalizar todo o secções coradas usando um scanscope com um objetivo 20X. </li><li> Medir a espessura da epiderme dentro de um segmento de 1 mm da epiderme e contar o número de células imunorreactivas-Ki67 no interior do segmento. NOTA: Quantitative análise é realizada usando microscopia de automação e imagem software de análise. A espessura da epiderme é definida pela distância entre a camada basal e a camada mais externa da epiderme. </li><li> Contar o número de células imunorreactivas Ly6G na área dérmica (230 x 270? M 2 rectângulo) imediatamente abaixo tópico da pele tratados com IMQ. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros para divulgar.

A etapa mais crítica para assegurar a expressão do DNA de plasmídeo acufected é a oscilar de forma uniforme e soltar a camada córnea da pele. Ao empurrar as agulhas suavemente sem cortar a pele, a força deve ser forte o suficiente para deprimir a superfície. Para facilitar a absorção de ADN em 10 de soluo de em um 1 cm x 1 centímetro a área de superfície, as agulhas devem oscilar para cima e para baixo para cerca de 100 vezes em 30 s. Pode-se determinar a força que tem de picar a pele e anotando o número d...

A pele é a primeira linha de defesa do hospedeiro. Os queratinócitos (KCs) são o tipo de célula principal na pele de seres humanos e ratinhos. Em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, luz solar, oxigénio, produtos químicos e invasão patogénico), KCs são activados e produzir uma vasta gama de citocinas prinflamatias e quimiocinas, tais como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α e GM-CSF 1. Juntos, desencadear o recrutamento de células do sistema imunológico para a pele. Inflamação cutânea agravada é muitas vezes associada com numerosas doenças humanas, incluindo a dermatite de contacto ectópico aguda e inflamação mediada por células T crónica (por exemplo, dermatite de contacto alérgica e psoríase) 2. Modular as respostas pró-inflamatórias da pele através da inibição da activação KC é uma abordagem aceitável para tratar a inflamação cutânea. Este protocolo descreve uma nova abordagem para expressar transitoriamente um gene de citoquina na epiderme, a fim de estudar res imunesponse como consequência de um tal tratamento na pele. A epiderme compõe a camada mais superficial da pele. Ele serve como uma barreira física manter as substâncias externas, tais como os ácidos nucleicos e os agentes patogénicos de entrar nas camadas mais profundas da pele. Várias técnicas sem agulha foram estabelecidas para a transferência de ADN epidérmico 3, 4. ADN em solução ou associado com lipossomas catiónicos ou vectores de adenovus foi directamente aplicado à epiderme modificados com técnicas tais como a remoção do estrato córneo ou para o tratamento com depilating reagente. A remoção do epitélio córneo facilita ADN de atravessar a barreira epidérmica e interacção com queratinócitos e células de Langerhans para induzir respostas imunes 5. Enquanto uma grande área de superfície está disponível para transferência de DNA e esta abordagem não envolve agulhas, há desvantagens, incluindo a exigênciapara as grandes quantidades de ADN (10 - 100), o tratamento dura sobre a pele por decapagem e os resultados inconsistentes na indução da resposta imunitária nos animais imunizados, sem reforço de entrega de ADN 6. Entrega intracelular mediada por micropartícula de ADN nu para a pele tem sido mostrado para ser altamente eficiente e reprodutível para a indução de resposta imune 7, 8. Uma pistola de genes de mão tem sido usado para bombardear o local alvo da pele com partículas de ouro revestidas com ADN de plasmídeo de 2 um de diâmetro em tamanho por meio de hélio pressurizado fluxo de ar 9. O DNA de plasmídeo é presumivelmente absorvidos pelas células dendríticas (DC) KCsand na pele e a proteína é expressa localmente ou ser transportado para nódulos linfáticos de drenagem por DCs 10. Embora o sistema arma gene é simples e requer experiência técnica limitada, o custo para a preparação e entrega dos &quot;bul DNAlet &quot;(isto é, pós de ouro, de gás hélio) e para a pistola de genes em si tem limitado a sua aplicação geral. Além disso, o requisito de um sistema de fornecimento de gás hélio limita a facilidade de transporte pistola de genes quando as experiências são realizadas em locais diferentes. microdispersão demonstrou-se conseguir uma maior eficiência de transferência de genes que única injecção e bombardeamento de partículas 11. microdispersão utiliza uma pistola de tatuagem para entregar ADN para a pele sem o uso de grânulos de partículas 11. oscilante as microagulhas na pele utilizando esta abordagem é provável raspar directamente a membrana celular e assim transferir DNA para várias células, ao mesmo tempo. no entanto, a dor associada com o grande número de injecções com agulhas 0,254 mm de diâmetro é uma desvantagem. Aqui nós fornecemos uma abordagem alternativa para a entrega de ADN in vivo. O &quot;acufection&quot; </strong&gt; protocolo que descrito aqui oferece uma maneira económica e eficaz para entregar o ADN de plasmídeo na pele do rato. Resumidamente, dez agulhas de acupunctura (0,2 mm de diâmetro x 13 mm de comprimento) foram ligados em conjunto por uma fita adesiva. Um volume de 10? L de PBS com 10 ug de ADN de plasmídeo contendo o transgene de interesse foi colocado sobre a pele tratada com creme de barba, creme depilatório flanco. Utilizando o feixe de agulhas de acupuntura para oscilar a superfície (1 cm x 1 cm) da pele, as queratinas na camada córnea foram soltos e o DNA de plasmídeo aplicada à superfície foi absorvido para dentro da epiderme. os danos da pele foi monitorado e encontrado para ser mínima. A expressão do gene transfectado na pele acufected foi confirmada por tanto quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) e ELISA. Os efeitos imunomoduladores dos entregue-acufection IL-15ΔE7 na inflamação cutânea foram demonstrada utilizando o modelo de ratinho tratado com IMQ 12. Enquanto acufection prova ser um dema fácil e menosnding método para entrega de ADN in vivo, a quantidade óptima de ADN para genes diferentes e os tempos para picar a pele tem que ser cuidadosamente optimizadas para obter resultados reprodutíveis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

A desregulação da resposta imune em pele está associado com numerosas desordens da pele humanos. transferência directa de genes imuno-relacionados no tecido da pele é uma abordagem fascinante para investigar a modulação imune de inflamação cutânea em modelos de ratinho de doenças humanas. Aqui apresentamos um protocolo de baixo custo que entregue DNA nu na pele do rato e leva a expressão do transgene. O método é cunhado &quot;acufection&quot;, que denota ADN mediada por punção trans fecção acu. Para realizar acufection, pele de ratinho foi infundido em primeiro lugar com ADN em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois picado levemente com um feixe de agulhas de acupunctura para facilitar a absorção de ADN e transfeco em culas. O DNA de plasmídeo é presumivelmente retomado pelo queratinócitos e células dendríticas (DC) na pele e expressa em proteína. Picada mecânica com o agulhas per se não causar danos à pele ou induzir a ativação de queratinócitos. A expressãodos genes transfectados foi detectado na pele, tanto a nível da transcrição e tradução seguintes acufection durante 2 dias e mantiveram-se a 7 dias. O objectivo principal para o desenvolvimento deste método acufection foi investigar uma isoforma anteriormente indefinido de IL-15. Usando este método, um splicing alternativo de IL-15 isoforma com remoção parcial do exão 7 (IL-15ΔE7) foi expressa na pele e subsequentemente tratado com um receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para induzir a inflamação. Acufection-entregue IL-15ΔE7 na pele suprimiu a proliferação de queratinócitos, a espessura da epiderme e o recrutamento de neutrófilos na inflamação cutânea induzida por IMQ. Com o aumento do interesse em identificar os mecanismos de regulação da inflamação cutânea, o protocolo aqui descrito proporciona um custo alternativo eficaz e versátil para o sistema de canh de genes ou microdispersão para entrega de ADN in vivo. Ele pode potencialmente permitir a descoberta da função de um romancegene na pele ou para a investigação de novos tratamentos para doenças cutâneas.

Enquanto alguns vermelhidão foi evidente durante a primeira hora depois da punção com agulhas de acupunctura, a pele foi afastada no dia 2, e não se observou qualquer reacção adversa da pele até ao dia 7 após repicagem (Figura 2A). Agulha de perfuração induzida nível muito baixo de ortoceratose epidérmica e dérmica infiltração mínima por meio de análise de H &amp; E em comparação com a pele não tratada (Figura 2B).</s...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Este protocolo é uma alternativa de custo eficaz para a expressão de ADN de plasmídeo despido na pele do rato. O objectivo geral do protocolo é a entrega de genes imuno-relacionados no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico em inflamação cutânea.

Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por &quot;Acufection&quot; e sua aplicação à Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K visualizações.  National Taiwan University College of Medicine.  Este protocolo é uma alternativa de custo eficaz para a expressão de ADN de plasmídeo despido na pele do rato. O objectivo geral do protocolo é a entrega de genes imuno-relacionados no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico em inflamação cutânea. 

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Desenvolvimento de um marcador negativo selecionáveis ​​para Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Imunologia e Infecção

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Desenvolvimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudar a interacção de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...