Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame R43 / R44 NS064661.

Siga as diretrizes institucionais para cuidados com os animais para esterilização ferramenta cirúrgica, e modificar o protocolo como necessário para cumprir as diretrizes e obter a aprovação pela Institutional Animal Care e Use Committee da sua instituição (IACUC). 1. Preparação cirúrgica <ol><li> Limpar e preparar o transmissor para garantir cirurgia segura e estéril. Retire o transmissor da embalagem anti-estática e ou spray ou mergulhar em etanol a 70%. Transmissor lavagem com solução salina estéril e lugar entre esponjas de algodão estéreis embebidas em soro fisiológico estéril ou continuam submersas em soro fisiológico estéril. </li><li> Recolha e esterilizar os instrumentos necessários para a cirurgia; autoclave de vapor durante a esterilização. Veja a tabela de materiais e reagentes para a lista de instrumentos cirúrgicos. </li></ol> 2. implantação cirúrgica <ol><li> Anestesiar animais e manter a anestesia acordo com o protocolo do IACUC-aprovado. No início e durante surgery verificar o reflexo toe-pitada cada 15 min. A ausência de resposta indica nível suficiente de anestesia. <ol><li> Para filhotes, utilizar anestesia por isofluorano (4%) com o O 2 (100%). Para os adultos, usar cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). </li></ol></li><li> Fixar a posição no quadro estereotáxico. Coloque as pontas de barras ouvido no conduto auditivo. Não aperte excessivamente barras de ouvido que o crânio é muito suave em filhotes de ratos jovens. Prenda o cone do nariz anestesia. <ol><li> Manter o animal aquecido durante a cirurgia, colocando-o na almofada de aquecimento definido para 37 ° C. Em animais adultos, aplique pomada lubrificante para os olhos do animal. </li></ol></li><li> Esterilizar local da incisão e manter campo cirúrgico estéril. <ol><li> Pincelar o couro cabeludo com aplicações alternadas de etanol a 70% e betadine. Iniciar-se no centro do couro cabeludo e tornar cada vez mais largos círculos concêntricos. </li><li> Cobrir o animal com cortina e realizar a cirurgia sobre animais drapeado. Manter os sterile campo cirúrgico, alinhando o cirúrgico set-up com campos estéreis, equipamento de pulverização com etanol 70%. </li><li> Usar luvas cirúrgicas estéreis e vestido (ou conforme exigido pela instituição). Para ajudar a manter campo estéril, use um assistente cirúrgico. </li></ol></li><li> Faça uma incisão no couro cabeludo do animal ligeiramente atrás dos olhos ao longo da linha média, cerca de 2 cm. Tenha cuidado ao inserir o bisturi como o crânio ainda é muito suave em filhotes de ratos jovens. Faça um único corte de modo a incisão sangra menos e cura mais rápido. </li><li> Expor o crânio. Prepara-se uma área limpa e seca para maximizar a ligação entre o transmissor e os ossos do crânio. Use clipes de aneurisma de entender couro cabeludo. <ol><li> Puxe delicadamente couro cabeludo longe da linha média em quatro cantos. Procure marcos anatômicos, tais como bregma e lambda no crânio. Lembre-se de ossos do crânio não são fundidos em animais nessa idade. Use os atlas Paxinos de coordenadas estereotáxica para encontrar o local correto para o orifício de trepanação. </li></ol&gt; </li><li> Use uma ferramenta Dremel-tipo com uma broca tipo rebarba. Criar dois furos burr em posições de gravação desejados com os buracos sendo maior do que 300 m de diâmetro. Colocar o orifício de trépano para o eléctrodo de referência durante o cerebelo atrás do lambda do crânio. </li><li> Assegure-se que os fios do transmissor estão alinhados com os orifícios da rebarba. Se os fios dos eléctrodos não estão alinhadas, cola contaminação dos eléctrodos é provável, e irá resultar em mau sinal. Para alinhar os fios, verificar o ajuste do transmissor e dobre eletrodos para alinhar sobre os locais destinados para buracos rebarbas. </li><li> Apare cabos-eletrodos. Utilize uma tesoura cirúrgica para cortar os eléctrodos, para o comprimento desejado. A profundidade do eléctrodo é importante para o tipo de gravação exigida para a experiência (isto é, se os eléctrodos de dura-máter acima para EEG, ou usar coordenadas estereotáxicas para as estruturas cerebrais definidos). </li><li> Liberalmente aplicar cianoacrilato sobre a base do transmissor to cobrir a área certificando-se de evitar o revestimento dos eletrodos. Cola de cianoacrilato é um isolante elétrico, contaminando eletrodos com cola irá resultar em nenhum sinal. <ol><li> Se gravar a partir de estruturas cerebrais profundas, montar o transmissor no suporte da cânula e coloque-o no braço estereotáxico para o controle do eixo z. Abaixe o transmissor usando o braço estereotáxico a profundidade adequada e coloque gel de cianoacrilato em torno do transmissor. </li></ol></li><li> Crânio completamente seco antes de colocar o transmissor para garantir a ligação adesiva forte. Aplicar transmissor revestido com cianoacrilato para o crânio. Tome cuidado para alinhar eletrodos com os correspondentes furos Burr. <ol><li> Tente evitar grandes estruturas vasculares prejudiciais. Segurar o transmissor no lugar com uma ligeira pressão durante um minuto. Utilize uma ligeira pressão para formar uma ligação forte entre o transmissor e o crânio. </li></ol></li><li> Aplique cianoacrilato adicional, o suficiente para selar completamente interface do transmissor / crânio. Para assegurar agood em forma e forte ligação, maximizar a área de superfície da cola que os contatos do crânio. Aplicar o adesivo de cianoacrilato em um círculo em torno do transmissor, certificando-se de ambos crânio e a parede do transmissor são cobertas. </li><li> Aplicar acelerador química (0,1 ml) através de uma seringa ao redor do cianoacrilato na base do transmissor implantado. Use acelerador com moderação, tomando cuidado para não se candidatar ao tecido adjacente. Nota: aceleração da cura química cianoacrilato assegura que a forte ligação entre o transmissor e o crânio é formado rapidamente. Cianoacrilato acelerador é útil para a cura do adesivo velocidade, mas não é necessário. </li><li> Remover o acelerador por lavagem da área cuidadosamente com solução salina estéril. Acelerador de cianoacrilato podem causar irritação dos tecidos não se lavou a partir da área da incisão. Para lavar a área, encher uma seringa de 1,0 ml com solução salina estéril e irrigar a área através de uma agulha de seringa. Geralmente 0,5 ml de solução salina é suficiente para lavaro acelerador. </li><li> Suturar a pele em torno da base do transmissor, mas não cobrem o transmissor. Top de transmissor deve estar acima de pele para transmitir sinais neurais de forma eficiente. A pele deve estar razoavelmente apertada em torno do transmissor e a cola em torno da unidade. Use Vicryl ou fio de seda (thread suave); pele em animais imaturos é macio e é facilmente danificada se suturas macias não são utilizados. Para animais adultos, usar qualquer material de sutura. </li><li> Remova animais de quadro estereotáxico e coloque no cobertor aquecida para recuperação. </li><li> Certifique-se de animais são quente (37 ° C) e ambulatorial (ou seja, completamente recuperado) antes de retornar para a represa. Certifique-se de que o animal está hidratado por beliscar a pele em volta do animal (se o animal está desidratado, a pele vai permanecer deformado). Se um animal está desidratado, administrar a injecção sub-cutânea de tampão de Ringer com lactato. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manterdecúbito esternal. <ol><li> Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) aos animais para a gestão da dor pós-cirúrgica e uma injecção sub-cutânea de 0,1 ml de bupivacaína em torno do local da injecção. Nota: Do início ao fim todo o processo deve ser concluída em 5-10 min para animais desta idade (dia pós-natal 6). O tempo cirúrgico pode levar mais tempo para os animais mais velhos. </li></ol></li></ol> 3. Cuidado e Habitação Nota: Algumas barragens podem não tolerar filhotes implantados com o dispositivo. Barragens podem precisar de ser seleccionado que são tolerantes. É aceitável para a barragem para mover os filhotes ao redor da gaiola por pegá-los pelo transmissor. <ol><li> Quando os animais são desmamados, isoladamente abrigar-los para evitar a remoção dos dispositivos de seu companheiro de jaula. </li><li> Euthanize animais por dose letal de pentobarbital (25 mg / kg) ou isoflurano (em uma redoma de vidro) quando sinais de sofrimento estão presentes. </li><li> Note, algumas gaiolas de alojamento dos animais com inserções fio pode, interFere com os transmissores implantados. Certifique-se de verificar a altura da inserção do fio para se certificar de que os animais não podem obter o transmissor preso entre as &#39;barras&#39; do inserto fio. Consulte seu veterinário para obter ajuda. </li></ol> 4. Gravação de EEG <ol><li> Colocar o animal numa gaiola, por si só ou co-alojado com ninhada e a barragem. No entanto, apenas um lugar implantado animal em uma única gaiola. Não deixe filhotes sozinha na câmara de gravação por mais de 2 horas. Monitorar os animais para sinais de sofrimento e desidratação. </li><li> Ligue a fonte de alimentação fornecida à base receptor e verifique a luz de energia está acesa. Ligue o receptor de base para um sistema de aquisição de dados usando cabos (baioneta Neil-Concelman) BNC. </li><li> Colocar o animal na gaiola de topo da base do receptor (Figura 2). A luz &quot;sinal&quot; deverá acender indicando um transmissor foi detectada. Os dados podem agora ser gravado. </li><li> TO registo de dados, ligar-se a base de receptor para um conversor analógico-digital e o conversor de ligar a um computador (Figura 1). </li><li> Definir a taxa de amostragem da gravação. Certifique-se de que os dados são amostrados adequadamente. Selecione pelo menos 250 Hz taxa de amostragem (500 Hz recomendado) para a gravação (largura de banda do transmissor é 0,1-100 Hz). </li><li> Salve os dados digitalizados e analisar o uso de pacotes de software de processamento de sinais, tais como Matlab. </li></ol> 5. Análise de EEG - Geral <ol><li> Execute FFTs (transformação rápida de Fourier) para transformar dados de EEG temporais para o domínio da freqüência de 0-100 Hz. </li><li> Realizar uma estimativa de densidades de energia espectrais (PSDS) da FFT usando 256 segmentos Hann-janela com base no método Welch e normalizada por 10 x 10 log (PSD). Os espectros de energia mostram as frequências específicas que dominam o sinal de EEG durante o período de tempo desejado. </li><li> Grupo de dados através animais tomando a média do PSD de cada animalem relação aos tratamentos combinados de tempo. Criar intervalos de confiança de 95%, em média 1,96 x (PSD) / raiz quadrada (n), onde n é o número de animais (vestígios PSD). Traçar os intervalos de confiança de média e 95% dos dados para gerar um relatório quantitativo de todo o conteúdo de freqüência do EEG através de grupos de animais, como comparar os grupos tratados vs grupos de controle. </li></ol> 6. Perinatal hipóxia-isquemia (HI) Protocolo Modelo <ol><li> Anestesiar o P6 - 7 filhote de rato com anestesia isoflurano (4% com 100% de O 2), colocando o animal em uma caixa de anestesia (caixa com a entrada de anestesia vaporizador). No início e durante a cirurgia verificar a toe-pitada reflexo a cada 15 minutos. A ausência de resposta indica nível suficiente de anestesia. </li><li> Coloque o filhote de cachorro em sua parte traseira, expor o pescoço e esfregue com aplicações alternadas de 70% de etanol e 10% de betadine. Repita o matagal etanol / betadine 3 vezes. </li><li> Fazer uma incisão de 1 cm na pele do pescoço com scissors na linha média do pescoço. Levante a pele com uma pinça e fazer o corte com uma tesoura. Tome cuidado para não cortar o tecido muscular ao fazer a incisão. </li><li> Use uma técnica de dissecção romba para expor artéria carótida. Para executar dissecção romba, usar dois pares de fórceps sem corte-nariz. Inserir as pontas para o tecido e que a acção de mola do instrumento cirúrgico espalhar o tecido. Repita até artéria carótida é exposta. Identificar a artéria carótida através de uma cor vermelho brilhante e a presença de pulso visível. </li><li> Artéria carótida separado do nervo vago com a pinça sem corte. Inserir a pinça de ponta romba entre a artéria eo nervo. Solte a pinça e deixar a ação da ferramenta primavera separar a carótida do nervo vago. </li><li> Lugar aneurisma grampos 4-5 mm de distância na artéria carótida. Tome cuidado para não danificar a artéria com os grampos, evitando movimentos rápidos. </li><li> Cauterizar a artéria carótida entre as pinças aneurisma. Para cauterizar a artéria, Toque na artéria entre os grampos com uma ponta cauterizador quente. Depois a artéria é cortada, garantir ambas as extremidades são adequadamente cauterizada para evitar hemorragia. </li><li> Remova os grampos, fechar a incisão no pescoço com 3 suturas. Somente suturar a pele, tomar cuidado para não suturar o tecido muscular. </li><li> Permitir que o animal recuperar durante 1 h. Controlar a respiração do animal e sangrando pelo pescoço. Se o sangramento está presente, não submeta o animal a HI (passo 6,10). </li><li> Colocar o animal numa câmara de temperatura controlada a 37 ° C e introduzir continuamente 8% de O2 / 92% N 2 para a câmara de mistura durante 2 horas. </li></ol>

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Neurotrauma. 29 (5), 789-812 (2012).</li></ol>

Drs. Lehmkuhle e Dudek têm um interesse financeiro em Epitel, Inc., projetistas do sistema de gravação biopotencial wireless Epoch.

Pode ser muito caro para fazer gravações eletrográficas longo prazo em modelos pequenos animais da doença. Ao contar com circuitos elétricos simples e enfatizando baixo consumo de energia, temos sido capaz de criar um sistema transmissor (Figuras 1 e 2), que reduz o custo de experimentos de acompanhamento de longo prazo. O custo total de uma experiência de monitorização de 6 meses pode ser tão baixo quanto $ 470, mais o custo do animal (~ $ 1,5 animais por dia, US $ 200 transmissor). O pequeno tamanho do transmissor permite gravações ininterruptas contínuas eletrográficas em pequenos animais, modelos pré-clínicos de doença humana, que são muito difíceis de obter com os sistemas de gravação sem fio baseadas em rádio-frequência ou tethered (Figura 4). Finalmente, a natureza montado no crânio do transmissor reduz o tempo de cirurgia e estresse sobre o animal que pode comprometer de outra forma um experimento. Aqui, mostramos experimentos de prova de princípio de três different modelos experimentais de apreensões: perinatal hipóxia-isquemia 13, 27, 28, em um filhote de rato (Figura 4), ​​epiléptico induzido por DFP status (Figura 5) e convulsões em um modelo induzidas geneticamente de malformações vasculares cavernoso (Figura 6). Possivelmente, o aspecto mais crítico para a obtenção de gravações eletrográficas livre de artefato, a longo prazo é o de verificar o acesso eletrodo desinibida para a região cortical de interesse (Figura 4-6). Isso inclui o eletrodo comum de referência / chão. Especialmente importante é fixar o transmissor ao crânio para aplicações EEG epidural. Durante este processo, é possível inadvertidamente revestir a ponta dos eléctrodos com cianoacrilato dado o comprimento curto dos eléctrodos. Revestimento dos eletrodos em cianoacrilato pode atenuar os sinais de EEG ou isolá-los completamente no pior cenário. Da mesma forma, a falta de boa conexão elétrica bntre o comum de referência / chão e cérebro do animal irá impedir o funcionamento correcto do amplificador diferencial no transmissor, resultando em um &quot;barulhento&quot; saída de sinal electricamente. Muitas vezes, após a cirurgia, os sinais de boa qualidade pode ser comprometida por até 48 horas devido a edema em torno dos furos da rebarba no crânio. À medida que o edema diminui, em geral, melhorar os sinais. Isto pode ser evitado através da colocação dos eléctrodos na superfície do crânio sem fazer furos da rebarba. As conseqüências desse processo são o aumento potencial para revestir os eléctrodos com cianoacrilato, redução da atividade de alta frequência devido aos baixos pass-características elétricas do osso do crânio, eo potencial para isolar eletricamente o ruído comum tornando referência / terreno nos sinais. Praticando a colocação correcta de eléctrodos pode ser feito com um pequeno pedaço de madeira ou folheado que imita a espessura do rato ou do rato do crânio. Os resultados apresentados neste manuscrito ilustrar a qualidade de gravações que podem ser obtidos utilizando tecnologia de telemetria sem fios. O implante cirúrgico, utilizando o método aqui descrito pode ter tão pouco como 10 minutos, dependendo da complexidade da cirurgia. Para o acesso cirúrgico para estruturas profundas do cérebro, tais como a região CA1 do hipocampo, é melhor para ligar o transmissor a um micromanipulador montado numa armação estereotáxica. O micromanipulador irá fornecer ao cirurgião com a precisão de implantar o transmissor de acordo com coordenadas estereotáxica publicado no Atlas do rato e rato 29 30 cérebros. Isto pode ser feito simplesmente por aderência de um pedaço de um tubo de agulha hipodérmica para o transmissor com cianoacrilato e, em seguida, a montagem da agulha hipodérmica no micromanipulador. Controlo micromanipulador de x, y, e z coordenadas vai proporcionar estabilidade adicional, quando a montagem do transmissor para o crânio antes da sutura da pele fechada. A adição de parafusos de osso em torno do perimeter do transmissor pode ajudar a ancorar o transmissor para o crânio, embora eles não sejam necessários. Os parafusos para ossos pode ser eficaz, no entanto, em certos modelos animais de epilepsia e convulsões, tais como o rato adulto tratado com lítio-pilocarpina. Estes animais tendem a ter crises convulsivas espontâneas com intensa atividade motora que podem danificar o transmissor durante a apreensão. Complexidade adicionais podem ser adicionados a estas experiências. Por exemplo, o transmissor é compatível com muitos modelos diferentes de lesão cerebral traumática, como o impacto cortical controlado 31. A durabilidade do dispositivo transmissor foi testada através da implantação de animais com transmissores em P7, e, em seguida, alojando-os na instalação para animais. Após 12 meses, a maioria dos implantes permaneceu intacto no crânio. Quando os animais foram sacrificados, os crânios parecia ser normal e o transmissor foi incorporado no osso do crânio, exigindo uma força significativa para o extrair. Tome cuidado quando as estruturas cerebrais profundassão estudados; como o cérebro cresce, e os eléctrodos de permanecer estacionário, a posição final dos eléctrodos é de esperar que altere. Para as técnicas descritas aqui, os eletrodos foram tipicamente posicionada acima da dura-máter, o que permitiu tanto o cérebro e do crânio para crescer e para eletrodos para permanecer em suas posições originais. O fator limitante em quanto tempo o transmissor pode ser usado é o tamanho da bateria (ou seja, até que a bateria se esgote). Um design monolítico auto-suficiente (ou seja, o transmissor é incorporado em epóxi duro) de habitação do transmissor presta-se a ser usado com filhotes imaturos alojados com a barragem e seus irmãos. Muitas vezes, a co-habitação animais com amarras resultados fio implantado na destruição da ferragem implantada ou cannibalization dos filhotes por barragem. A forma de parede lisa do transmissor permite a implantação com praticamente nenhuma falha de hardware ou perda de filhotes devido a canibalização. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; O esquema de transmissão acoplados à capacitiva baixo consumo de energia neste sistema presta-se bem para o uso em muitos cenários experimentais diferentes, tais como a colocação em uma incubadora com temperatura controlada ou mesmo para uso com aparelhos experimentais, tais como câmaras de pletismografia. Da mesma forma, a forma da antena do receptor pode ser manipulado para caber em muitos ambientes diferentes, comportamentais, tais como o intervalo T elevado maze.The do transmissor é apenas algumas polegadas como o transmissor deve ser capaz de &quot;carro&quot; (par capacitivamente a) o receptor e antena baseia-se no animal a ser alojados em gaiolas padrão para roedores ou gaiola adequada coberta pela área de superfície do receptor de antena. O transmissor funciona como um pólo de um campo eléctrico ao passo que o corpo do animal actua como um outro pólo. O campo é de tal modo que determinadas linhas de orientação, tal como 90 ° fora-de-fase com a antena do receptor, vai falhar para dirigir a antena do receptor, resultando em uma &quot;gota para fora&quot;. Esta é uma ocorrência bastante raro. Futuros trabalhos com esta tecnologia permitirá a gravação de vários animais na mesma gaiola que irá reduzir os custos de embarque e permitir a interação social. Outros desenvolvimentos irão envolver o aumento do número de canais, incluindo temperatura, e electromiograma. O design atual do dispositivo fornece uma largura de banda que é otimizado para recodificação de bandas clássicas de EEG, que não é adequada para gravação de ondulações rápidas ou oscilações de alta freqüência. No futuro, o dispositivo pode ser modificado para gravar os componentes do sinal de alta frequência, mas com o custo de vida útil da bateria. Diferentes tipos de transdutores incluirá a pressão arterial e pressão-volume, e até mesmo a construção de um arranjo de eletrodo transmissor para dimensões especificadas pelo usuário de acordo com coordenadas estereotáxicas das estruturas cerebrais desejados.

O mais antigo - e ainda o mais utilizado - técnica de gravação biopotenciais no cérebro é o eletroencefalograma (EEG). Ele é usado clinicamente para anormalidades neurológicas, incluindo a detecção apreensão 1, a localização de focos de apreensão 2, e diagnóstico de concussão 3,4. Essa técnica também é amplamente usado para fornecer informações fundamentais sobre os mecanismos do sono e para diagnosticar distúrbios do sono 5,6. Como no diagnóstico clínico das epilepsias, o EEG se tornou indispensável para a investigação translacional em modelos animais de epilepsia tanto genética e adquirida. Em aplicações de investigação em curso, &quot;wired&quot; ou gravações &quot;amarrados&quot; são padrão, e são rotineiramente realizados em roedores adultos por semanas em um momento 7. No entanto, o ruído elétrico, artefatos de movimento, eo risco de que tethered animais vai ferir-se, puxando o cabo tem compr longosomised estes experimentos. Assim, para melhorar as condições e as taxas de sucesso experimental, precisamos desenvolver novas tecnologias que permitam a eliminação da interface com fio entre o animal e instrumentação. A área mais óbvia de desenvolvimento é o projeto e implementação de sistemas de telemetria que permite a gravações de alta qualidade, mantendo uma longa vida útil e minimizar o desconforto para os sujeitos animais. Reduzindo o tamanho físico destes dispositivos permitirá que a investigação translacional em modelos de roedores neonatais e juvenis de distúrbios neurológicos. Gravações de baixo número de canais de EEG em ratos são empregados extensivamente para desenvolver novas terapias para suprimir crises epilépticas capaz de tradução para os seres humanos. Gravações de um ou mais locais por um período prolongado abrir muitas possibilidades para o uso de modelos de roedores de epilepsia na investigação translacional. Grande parte da investigação contemporânea neste campo tem como objectivo bloquear a ocorrência de Seiz crónicaas medidas ou o desenvolvimento de epilepsia (isto é, epileptogï¿½ese), e tais esforços de investigação requerem extensa se ​​EEG não contínua para ensaiar a eficácia da terapia 8 proposto; um sistema pequeno, simples, telemétrica com um, dois ou quatro canais que operam entre 0,1-100 Hz por canal irá promover fortemente esse tipo de investigação translacional. Eletrográficas apreensões ocorrem frequentemente com comportamentos mínimas (certamente sem convulsões), o que limita a utilidade de ensaios baseados em apreensões comportamentais. A estratégia de combinar a gravação de EEG e monitoramento de vídeo simultânea permite a possibilidade de capturar cada apreensão; e, além disso, estas abordagens analíticas podem permitir a avaliação quantitativa dos picos intercríticos que ocorrem no cérebro epiléptico entre os eventos 9 &quot;ictal&quot; (ou captura). Além disso, a capacidade de obter contínua de alta qualidade a baixo artefato gravações de EEG, para o qual a tecnologia sem fio é geralmentesuperior, vai permitir o desenvolvimento da utilização de algoritmos baseados em computador para estudar formas de onda de EEG específicas (por exemplo, teta, gama), bem como a detecção automática de convulsões, reduzindo de forma significativa a carga de trabalho do experimentador. O modelo pré-clínico para estudar epilepsia primária crónica após lesão cerebral é o rato ou o rato, ou por meio de um quimio-convulsivante (por exemplo, ácido caínico ou pilocarpina) ou induzido electricamente o estado epiléptico (SE), que é seguido por epilepsia crónica. Sob estas condições, as convulsões severas associadas com SE ou as convulsões nos animais subsequentes epilépticos podem levar a lesão do animal ou rasgamento puxando a corda e desapertando os parafusos que mantêm a ligação do headcap. Em última análise, é esse problema que geralmente termina estas experiências, e ainda a necessidade de obter registros de EEG de alta resolução a longo prazo para experimentos que visam o desenvolvimento de novas terapias para a crônicaepilepsia é primordial. Além disso, a habitação, monitoramento e análise de dados provenientes de animais a longo prazo implantados é um investimento considerável em ambos os custos directos e tempo de investigador; portanto, a cessação prematura da experiência pode resultar em custos significativos para os pesquisadores. Como esses modelos de progresso epilepsia, as crises geralmente tornam-se mais freqüentes e mais graves 10-12, aumentando a probabilidade de que os animais são feridos, assim como a sua utilidade para o desenvolvimento de novas terapias torna-se maior. Estes animais podem desenvolver rotineiramente dezenas de crises convulsivas por dia, muitas vezes ocorrem em clusters 13. Provavelmente um dos mais importantes desenvolvimentos da ciência biomédica tem sido o uso de gene alvo em modelos de ratos. Esta abordagem permitiu, e vai continuar a permitir que, o desenvolvimento de modelos animais de epilepsia genética que reproduzem síndromes humanos reais 14-16. Manipulações genéticas pode ser realizada comoterapias de prova de princípio para reprimir ataques epilépticos ou mesmo bloquear o desenvolvimento da epilepsia após uma lesão cerebral 17-20. Este tipo de pesquisa iria beneficiar muito a capacidade de executar high-throughput gravação contínua do EEG. Atualmente, é possível gravar a partir de ratos com ambos os sistemas de telemetria ou amarrados; No entanto, os desafios de obtenção de uma elevada qualidade, gravações, sem efeitos artificiais são substancialmente mais difíceis do que os ratos, e muitas vezes este requer várias formas de mochilas que ratinhos tentam continuamente para remover. Estresse pode aumentar gravidade das crises, frequência e / ou duração, e, assim, acabaria por modificar a epilepsia dos animais experimentais, confundindo assim o estudo. Um leve, baixo perfil pequeno sistema, telemetria miniatura irá facilitar a gravação de longo prazo EEG de modelos genéticos do rato da doença humana. Em adição aos problemas acima descritos, o registo de EEG no modelo de roedor imaturos da doença tem seu próprio conjunto de desafios. Animais imaturos pode pesar tão pouco quanto 6 g (P8 mouse) para 17 g (P6 rato). É praticamente impossível fazer multi-dia EEG amarrados em série devido ao aumento do estresse de baraço e incapacidade para permitir criação natural do cachorro pela barragem. Até animais são desmamados, eles devem permanecer sob os cuidados da barragem. A barragem está propenso a destruir qualquer conjunto de conectores exteriorizado no filhote, terminar o filhote, e em alguns casos encerrar toda a ninhada. Além disso, o crânio roedor imaturo dificulta a montagem de pedestal qualquer eléctrodo ao crânio com integridade mecânica. Estes desafios, exclusivo para roedores imaturos, exigem uma solução inovadora para fazer gravações eletrográficas robusto e de longo prazo. Aqui vamos nos concentrar em demonstrar a implantação ea gravação de EEG usando um transmissor sem fio em miniatura romance e apresentam três experimentos de prova de princípio como exemplos de utilização do sistema de telemetria sem fio em miniatura: 1) a immadura modelo filhote de rato de hipóxia-isquemia, 2) ratos adultos tratados com DFP para induzir estado de mal epiléptico e crises espontâneas subsequentes, e 3) modelo genético de malformações cavernosas vasculares que resultam em convulsões e morte em ratos adultos. O sistema de telemetria sem fio em miniatura foi projetado para atender quatro requisitos principais: (1) a implantação cirúrgica minimamente invasiva; (2) compatibilidade para a habitação de filhotes de roedores com a barragem e irmãos; (3) de baixo consumo de energia da unidade, permitindo assim a monitorização contínua de meses sem re-implantação cirúrgica; e (4) capacidade de gravar curvas EEG de alta qualidade com o mínimo de artefatos de movimento. O transmissor sem fios pesa &lt;0,6, 2,3, e 4 g, e é &lt;0,3, 0,8, e 1,4 cm3, dependendo da bateria com uma pegada de 5 x 7, 7 x 9, ou 7 x 12 mm que pode ser montada facilmente no crânio do animal com gel de cianoacrilato. Sem buchas osso são necessárias para afixar de forma segura o dispositivo parao crânio, a redução do número de furos que têm de ser perfurado no crânio e o tempo de cirurgia. O dispositivo é capaz de amplificar dois canais de EEG ou locais potenciais de campo de estruturas profundas do cérebro, tais como o hipocampo, por mais de 2 semanas, 2 meses, ou 6 meses nesta configuração. O pequeno tamanho do transmissor sem fios reduz o risco de infecção, aumenta a mobilidade dos animais, e em última análise, reduz a morbidade e mortalidade que de outra forma, aumenta o tempo, dinheiro, e número de animais necessários para uma experiência. Todos os produtos eletrônicos e bateria são envasadas em epóxi de grau médico que torna o dispositivo à prova d&#39;água e resistente, impedindo a barragem de mascar sobre o transmissor que poderiam tornar o dispositivo inoperante. Ao contrário de transmissores de rádio-frequência, o sistema de telemetria utiliza acoplamento capacitivo entre o transmissor e uma antena de receptor que fica abaixo da gaiola animal, permitindo ao usuário manter os animais em habitação roedor padrão. Vários canais de recording permitir a gravação de biopotenciais multi-modais, como eletrocardiograma e eletroencefalograma. Modelos animais de co-morbidades, vai beneficiar a capacidade de gravar biopotenciais durante comportamento 21-23. Combinando comportamento com EEG irá fornecer aos pesquisadores uma melhor ferramenta para pesquisas e estudos pré-clínicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gloves</td>
			<td>Protective Industrial Products</td>
			<td>100-3201 PF</td>
			<td>Power Free Sterile Latex Surgical Glove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade #15</td>
			<td>FST</td>
			<td>10015-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burr tool</td>
			<td>Ram Products, Inc.</td>
			<td>Microtorque II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine burr</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneurism clip</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11022-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped applicators</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>24-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Driver</td>
			<td>WPI</td>
			<td align="right">521725</td>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate gel</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Loctite 4541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate accelerant</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Loctite 7452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td colspan="2">Vicryl RB-1 J304</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elecrocautery disposable</td>
			<td>Bovie</td>
			<td>AA01</td>
			<td>Fine Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tray</td>
			<td>FST</td>
			<td>20311-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitel Receiver Base</td>
			<td>Epitel Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitel wireless transmitter</td>
			<td>Epitel Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopac digitizer</td>
			<td>Biopac</td>
			<td>MP-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-compatible computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term continuous eeg monitoring in small rodent models of human disease using the epoch wireless transmitter system

Muitas doenças neurológicas progressivas em seres humanos, tais como a epilepsia, requerem modelos animais pré-clínicos que se desenvolvem lentamente a doença, a fim de testar as intervenções em vários estágios do processo da doença. Estes modelos animais são particularmente difíceis de implementar em roedores imaturos, um organismo modelo clássico para o estudo de laboratório desses transtornos. Gravação de EEG contínuo em modelos animais jovens de convulsões e outros distúrbios neurológicos apresenta um desafio técnico devido ao pequeno tamanho físico dos roedores jovens e sua dependência da barragem antes do desmame. Portanto, não existe apenas uma necessidade clara de melhorar a investigação pré-clínica que irá identificar melhor essas terapias adequadas para a tradução para a clínica, mas também uma necessidade de novos dispositivos capazes de gravação contínua EEG em roedores imaturos. Aqui, nós descrevemos a tecnologia atrás e demonstrar a utilização de um novo sistema de telemetria miniatura, especificamente para uso em ratos imaturos ocamundongos r, que também é eficaz para uso em animais adultos.

Foi desenvolvido e implementado o conceito de gravação EEG de um único roedor adulto, esquematizada na figura 1 para o processo de aprovação do IACUC, o projeto deve integrar-se bem em instalações animais institucionais existentes.; portanto, o sistema foi projetado para ser facilmente instalado em uma instalação padrão de animais sem o uso de espaço adicional: o animal é alojado em um &quot;animal instalação de questão&quot; gaiola de habitação regular que é colocado dentro de um receptor com uma gaiola de Faraday integrada para reduzir ruído elétrico. O sinal de cada receptor de base é conduzida por fios a um digitalizador que está ligado a um computador (Figura 1). Um único computador é necessário para recolher dados a partir de até 32 animais registados simultaneamente, dependendo da capacidade do sistema de aquisição de dados do utilizador. Este tipo de configuração consome pouca energia e produz pouco calor, um recurso compatível com instalações para animais de clima controlado. Os dados podem serexibido em tempo real no monitor, permitindo o monitoramento experimental, e armazenado a longo prazo sobre discos rígidos externos (unidade de armazenamento de 10 TB). A fim de minimizar os danos de maca-companheiros e filhote de cachorro canibalização pela barragem, testamos vários fatores de forma transmissor. O desenho final foi um cilindro de cúpula; uma forma difícil para ratos morder e danos. Um transmissor individual no crânio de um rato adulto é mostrado na Figura 2A e uma versão inicial de alta densidade (32 animais) bases receptor e plataformas de gravação em que a habitação roedor padrão é colocado é mostrado na Figura 2B. A eficiência energética foi uma consideração extremamente importante; escolhemos o acoplamento capacitivo como um protocolo de transmissão de dados. O seguinte projeto permite a gravação contínua EEG por mais de 6 meses, dependendo da capacidade da bateria (Figura 2A). Ratos tão jovens como dia pós-natal 12 (P12, Figura 3A) e ratos como os jovens como P6 (Figure 3B) tolerar o transmissor bastante bem. A adesão do transmissor para o crânio com cianoacrilato permite animais a crescer com o transmissor na idade adulta (Figura 3C), enquanto se mantém contínua aquisição de dados de EEG. O fator de forma miniaturizada única da interface transmissor sem fio e presta-se para o trabalho com modelos animais de condições neo e perinatal. Os dados na Figura 4 mostra-dois canais de EEG de sub-aguda a actividade convulsiva que se segue (a ligação da artéria carótida, seguido por 2 horas de hipoxia com 8% de O2 mistura) do enfarte isquémico-hipóxico (HI) em um P7 Sprague-Dawley filhote de rato 13. O tratamento HI provoca uma grande lesão no hemisfério ipsilateral à carótida ligado. Aqui, as gravações mostram um conjunto de duas apreensões generalizadas sobre os dois hemisférios do cérebro ferido. O traço preto representa a actividade EEG no hemisfério contralateral à lesão, oazul rastreamento mostra EEG nos hemisférios ipsilateral (ou seja, na área da lesão). Enquanto a atividade de apreensão está presente em ambos os hemisférios do cérebro, o hemisfério ispilateral mostra EEG supressão de fundo, o que é indicativo de dano cerebral permanente 21. O estado epiléptico pode ser induzida em ratos adultos, injectando os animais com o organofosfato, DFP 22,23. Os dados na Figura 5 mostram descargas EEG repetitivas, que são indicativos do estado epiléptico (ver expansões temporais Figura 5A, B). Abaixo os vestígios da amostra, o campo de tempo do estado epiléptico durante 12 horas foram analisados ​​com um modelo não-linear de efeitos mistos que quantifica a intensidade das convulsões ao longo do tempo. A gravidade do estado de mal epiléptico é definido pelo poder EEG na banda gama (20-60 Hz). Aqui, o poder acima descrito foi na média de 12 animais e traçados ao longo de 12 horas, com intervalos de confiança de 95%. º<html> e os dados mostram um aumento acentuado na gama de potência na primeira hora de tratamento DFP, que persiste ao longo de 12 horas durante o qual os animais foram monitorizados continuamente. O método de análise que se segue permite uma medida quantitativa da gravidade do estado epiléptico aguda, um fenómeno anteriormente analisada principalmente com medidas comportamentais. Incluímos esta técnica de análise como um exemplo, uma vez que utiliza o cálculo de potência EEG em bandas clássicas e tem sido amplamente utilizado em estudos pré-clínicos para testar a eficácia de medicamentos anti-convulsivos no nosso laboratório 24-26. Possivelmente, o aspecto mais valioso de fazer contínuos, gravações ininterruptas sem fio com a telemetria sem fio é a capacidade de gravar eventos espontâneos anormais que ocorrem com baixa incidência. Estes tipos de dados demonstram a ampla utilidade do sistema de transmissão sem fios. 554fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Esquemática do sistema de gravação Epoch O sistema de gravação sem fio é composto por dois componentes: 1) um transmissor sem fios crânio-montado que amplifica a sinais vitais, e 2) uma placa de receptor colocado sob habitação roedor padrão. A saída da base do receptor é um sinal analógico que consiste na bio sinais desmodulados amplificado até um máximo de 4 V pico-a-pico. Este sinal pode então ser alimentado a um sistema de aquisição de dados para gravação. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig2.jpg" /> Figura 2:. O transmissor e receptor Este transmissor sem fios particular (A) pesa 4 g e desloca &lt;1,4 centímetros 3 de volume e com uma pegada de 7 x 12 mm é facilmente montado para a calvária de ratos e ratinhos. O transmissor pode amplificar dois canais de biopotenciais de até 6 meses após o qual a bateria é de drenagemed. Pilhas maiores podem ser utilizados durante mais tempo de gravação. Os animais são colocados em gaiolas de roedores padrão no topo do receptor Epoch (B). Mostrado à direita é um exemplo precoce de duas plataformas de gravação separadas, cada uma capaz de gravar a partir de 16 animais demonstrando simultaneamente o relativamente pequeno footprint (2 &#39;x 4&#39;, cerca de 60 centímetros x 120 cm) de cada uma das plataformas de gravação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig3.jpg" /> Figura 3:. Implantar o transmissor sem fio em ratos e camundongos O transmissor permite gravações de EEG contínuo para até 6 meses em ratinhos como os jovens como dia pós-natal 12 (P12, em cima). A fotografia do meio é de um filhote de cachorro P7 rato implantado com o transmissor em miniatura. O transmissor mantém firmemente ligado ao crânio como o animal amadurece. O animal é, no fundo, P280 e foi implantado com um transmissor sham em P7 idade. O sistema permite simultaEEG cutâneas e contínuas de vários animais com idade P7 através de desmame, reduzindo o número de ninhadas necessários para pré-clínica, a longo prazo, estudos de monitoramento de EEG. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig4.jpg" /> Figura 4: Dual-channel gravação hipóxia-isquemia convulsões induzidas com o sistema de telemetria gravações de dois canais de EEG anormal com a telemetria sem fio em um filhote de cachorro P7 ratos após a ligadura de carótida (isquemia) durante 8% O 2 tratamento (hipoxia).. (A) e (B), expandido vistas de formas de onda. A atividade de apreensão está presente em ambos os hemisférios (preto, azul) com substancial supressão EEG presente no hemisfério com infarto isquêmico (azul). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig5.jpg" /> Figura 5: Gravação epilepti estadocus em ratos adultos. gravações de EEG de superfície (ie, dural) com o sistema de telemetria sem fio em miniatura em resposta a diisopropilfluorofosfato (DFP) tratamento em um rato adulto. Os períodos sombreadas no topo trace (A e B) são vistas de formas de onda expandida em traços abaixo. Os dados registados com o transmissor sem fios pode, então, ser analisados ​​no domínio da frequência, permitindo comparações estatísticas de uma coorte de animais. (C) Os dados são médias e os intervalos de confiança de 95% de energia de banda gama (20-60 Hz) seguintes epiléptico induzido por DFP estado (N = 12) ao longo de 12 h após a administração de DFP. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig6.jpg" /> Figura 6:. A gravação de convulsões e alterações no EEG em um modelo de camundongo transgênico de malformações cavernosas vasculares Aqui, gravar a partir de um camundongo transgênico (A) tha está passando por atividade de apreensão. Na primeira, padrão EEG normal é presente (1); imediatamente antes da tomada, há um período de depressão pré-ictal (2), que é seguido por um conjunto de cinco convulsões (3). Seguindo as convulsões, descargas anormais ictais estão presentes no sinal (4). Controle de animais não tem convulsões e sem características anormais de EEG (B).

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Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System

Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.

Monitorização EEG contínuo a longo prazo no pequeno roedor modelos de doença humana, utilizando o Sistema Epoch transmissor sem fio

Many progressive neurologic diseases in humans, such as epilepsy, require pre-clinical animal models that slowly develop the disease in order to test ...

long-term-continuous-eeg-monitoring-small-rodent-models-human-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.4K visualizações.  Yale University School of Medicine. Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.

Vídeo: Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Neurociência

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analisando a atividade Neural e conectividade usando dados de EEG intracraniano com SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...