Este trabalho foi financiado pela Max Planck Society, o alemão Cancer Research Center, da Universidade de Tübingen, eo Bundesministerium für Bildung und Forschung (conceder nenhum. 0.312.040). Agradecemos Eduard Hermann por nos ajudar a automatizar a análise dos dados curva de força e Dr. Jakob Suckale para a leitura cuidadosa deste manuscrito.

1. Preparação de Bicamadas Lipídicas suportados (SLB) 11,12,21 <ol><li> Preparação de mistura de lípidos e de Vesículas multilamelares Suspensões <ol><li> Preparar os seguintes tampões de antemão. <ol><li> Preparar tampão PBS a concentrações de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM de KH 2 PO 4, 8 mM de Na 2 HPO 4, e 137 mM de NaCl, pH 7,2. </li><li> Prepare SLB (suportado bicamada lipídica) em concentrações de tampão de 150 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, pH 7,4. </li><li> Prepara-se uma solução de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Dissolve-se os seguintes lípidos em clorofórmio a uma concentração desejada: por exemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / mL e colesterol (Chol) a 10 mg / ml. </li><li> Aqui 18,38 ul de DOPC, 17,10 mL de SM e 11,30 mL de Chol para fazer uma solução com 1 mg de lipidos totais na proporção de 2: 2: 1 de DOPC: razão molar Chol: SM. Variar os volumes em conformidade com base no concentrations dos lipídios preparadas em 1.1.2. No entanto, manter a proporção molar de 2: 2: 1 de DOPC: SM: Chol, como alterar a relação molar irá alterar as características de fase da membrana 25. </li><li> Misture a solução completamente por agitação em vórtex. Adicionar um corante fluorescente lipídica a 0,05% molar, se alguém deseja visualizar a bicamada por um microscópio de fluorescência. Nota: A família de dialkylcarbocyanines de cadeia longa, como o fez, DII e DiO abrangem uma ampla gama de comprimentos de onda e pode ser preferencialmente utilizadas para etiquetar membranas lipídicas. Alternativamente, lípidos marcados com fluorescência, assim como a rodamina-fosfatidiletanolamina ou BODIPY-colesterol pode ser utilizado. Em qualquer caso, a concentração do corante deve ser optimizado de acordo com a configuração de microscopia, mantendo em mente que as altas concentrações do fluoróforo ligado ao lípido pode alterar o comportamento de lípido 19. </li><li> Seque o clorofórmio utilizando gás N2 (ou qualquer gás inerte disponíveis, tais como Ar e He). </li><li> Além disso seco tele lípido mistura sob vácuo durante pelo menos 1 h. Nota: Se armazenar esta mistura de lípidos, purgar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. Alíquota excesso de lípidos-em-clorofórmio em pequenos frascos castanhos. Secá-las de uma maneira semelhante como a mistura de lípidos, deslocar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. </li><li> Dissolve-se os lípidos secos em tampão PBS até uma concentração de 10 mg / ml. </li><li> Vortex-se a mistura vigorosamente durante cerca de 20 segundos a 1 min para obter uma suspensão turva, contendo vesículas multilamelares. Certifique-se de que não há a filmes lipídicos adira às paredes do frasco. </li><li> Distribuir esta suspensão em alíquotas de 10 ul (1 mg de lípido torna alíquotas de 10). </li><li> Armazenar a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Preparação de Vesículas Unilamelares Nota: Os vários tamanhos de vesículas unilamelares podem ser preparadas utilizando o método de sonicação ou o método de extrusão. Sonication usa sound energia para agitar a mistura e separar as camadas da suspensão multilamelar. Isto é indicado por limpar da suspensão turva. Extrusão obriga as vesículas multilamelares de passar através de um filtro de membrana com um tamanho de poro definido. <ol><li> Método de sonicação <ol><li> Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB. </li><li> Transferir a mistura em pequenos (2 ml) frascos de vidro tapados e selar com Parafilm. </li><li> Sonicar a mistura à temperatura ambiente num banho de ultra-sons durante 10 min ou até se tornar clara, para se obter pequenas vesículas unilamelares (SUVs, abaixo de 50 nm de diâmetro). </li></ol></li><li> Método de extrusão <ol><li> Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB. </li><li> Transferir a suspensão para um tubo criogénico. </li><li> Congelar a suspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico por alguns segundos em azoto líquido. </li><li> Descongele osuspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico num banho de água à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante alguns minutos. Repetir os passos de congelamento e descongelamento, pelo menos, 10 vezes. </li><li> A fim de extrusão da suspensão de lípido, utilizar uma membrana de policarbonato com 200 nm de tamanho de poro (outros tamanhos dos poros estão disponíveis como, 100 nm ou 400 nm) e um dispositivo de extrusão comercial 26. Nota: Actualmente, existem dois dispositivos de extrusão comercialmente disponíveis: um extrusor manual está disponível para pequenos volumes (200 uL para alguns mL). Neste caso, a amostra é submetida a extrusão através da membrana, empurrando manualmente a suspensão e para trás entre duas seringas. Dependendo do fabricante, alíquotas de lípidos teriam de ser combinadas para atingir o volume mínimo do conjunto acima. Para volumes maiores (até 50 ml) dispositivos mais sofisticados são utilizados em que a suspensão é forçada através da membrana de policarbonato utilizando gás comprimido. Condições de set-up e extrusão pode mudar de acordo com o model. Consulte as instruções do fabricante antes de usar. Este protocolo refere-se ao extrusor manual para pequenos volumes. </li><li> Equilibrar a extrusora em água por passagem da água através da extrusora. Imergir a membrana na água. </li><li> Colocar a membrana entre os dois pistões, montar o dispositivo e equilibrar em tampão, fazendo passar o tampão através da extrusora, a partir de uma seringa para a outra. Este passo permite adicionalmente ensaios de leakiness do sistema. Se ele vazamentos, desmontar e remontar-lo novamente alterando a membrana. </li><li> Tome a suspensão lipídica usando uma seringa da extrusora (&quot;lado sujo &#39;). </li><li> Introduzir a seringa que contém a suspensão de lípido em uma câmara e a seringa vazia na câmara oposta. </li><li> Empurre a seringa em uma extremidade. Filtrar a solução através da membrana e para dentro da seringa oposta. Este é o passo 1 r. </li><li> Passá-lo através da membrana para um total de 31 vezes taisque a solução acaba na seringa adversária (&#39;lado limpo&#39;). Nota: Verifique a membrana após a extrusão. Se ele foi quebrado, então o processo de extrusão não foi bem sucedida e necessita de ser repetida. </li><li> Esvaziar a seringa num pequeno tubo. As grandes vesículas unilamelares (LUV) são estáveis ​​durante 1-2 dias se mantida a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de Mica e Lamelas <ol><li> Lavar lamelas primeiro em água e depois em etanol. Ar seco. </li><li> Tome discos de mica e descolar a camada exterior usando fita adesiva. </li><li> Coloque o disco de mica sobre a lamela. Colas ópticas transparentes são ideais para que se possa verificar as camadas duplas com um microscópio de fluorescência. </li><li> Anexar cilindros de plástico (2,5 cm de diâmetro externo, diâmetro interno 2 cm, e 0,5 cm de altura), utilizando óptica cola / graxa. Certifique-se de que tudo está selado e que não há fugas. Use graxa quando querendo voltar a utilizar os cilindros como eles podem ser facilmente retirado do the lamela e lavados. As dimensões dos cilindros de plástico depender do tamanho do suporte do braço de suporte de AFM e devem ser ajustados em conformidade. </li></ol></li><li> Deposição de Unilamelares vesículas em suporte sólido <ol><li> Pipetar toda a solução de lipossomas directamente sobre a mica. Adicionar mais tampão SLB para chegar a um volume de 300 ml. </li><li> Adicionar 0,9 ml de solução 1 M de cloreto de cálcio para alcançar uma concentração final de 3 mM de Ca 2+. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2 minutos e depois a 65 ° C durante pelo menos 10 min. Sempre cobrir as bicamadas com tampão. O contato com as bolhas de ar e ar irá destruí-lo. Durante a incubação, adicionar mais tampão, se necessário, especialmente se a incubação a temperaturas mais elevadas. Nota: As temperaturas de incubação variam de acordo com as misturas de lípidos e as fases necessárias. É necessário um período de incubação de pelo menos 10 minutos para formar bicamadas suportados, mas pode ser mais longo, dependendo da temperatura e composição. </li><li> Lavagema bicamada com quente (65 ° C) Tampão de SLB 15-20 vezes para remover o cálcio e vesículas não fundidas. Tome cuidado extra durante as etapas de lavagem para manter a bicamada sob tampão e pipeta suavemente a solução de lavagem para evitar a destruição da camada dupla. </li><li> Bilayers legal suportados à temperatura ambiente antes medições AFM. Isto é necessário para formar as diferentes fases da membrana, bem como minimizar o desvio térmico no instrumento. </li></ol></li></ol> 2. Microscopia de Força Atômica Medidas 11,12 <ol><li> Imagem Nota: Execute projeção de imagem atômica no modo de contato ou o modo de tocar. Imagem suportado bilayers em solução; Não deixe que a solução para evaporar completamente, pois isso irá destruir as camadas duplas. Como era de se estar trabalhando com tampão, observe as precauções de segurança para garantir que qualquer parte AFM está protegido contra derramamento de líquidos. <ol><li> Selecione um cantilever macio (abaixo de 0,2 N / m constante da mola é aconselhável) e montá-lo para tele AFM. A escolha da rigidez cantilever é mais crítico para a espectroscopia de força (e isso será discutido mais tarde). </li><li> Monte a amostra no palco AFM e certifique-se que todos os módulos vibração de isolamento estão ligados. Aguarde pelo menos 15 minutos para equilibrar e reduzir a dispersão térmica do sistema. Dependendo da AFM set-up, especificações de ajuste e de imagem podem variar. Consulte o manual do fabricante. </li><li> Aproxime-se da amostra com a ponta do AFM até que o contato. </li><li> Desde bicamadas lipídicas são geralmente 4 nm de altura, utilize o Z-gama do instrumento que lhe dará a mais alta resolução z (por exemplo, 1,5 mm). </li><li> Selecione uma região para a imagem. Para obter uma visão geral da bicamada lipídica, uma 50 mm x 50 mm ou 25 mm x 25 mm região será um bom ponto de partida para a imagem. Se aparecer pequenos recursos, imagem uma lata em áreas menores (10 mm x 10 mm, ou 2 mm x 2 mm). A escolha de uma área de imagem depende também da r trabalhandoange do scanner piezoeléctrico. Por favor, consultar o manual do instrumento para isso. </li><li> Como camadas duplas são muito frágeis, ajustar o ponto da ponta do AFM conjunto durante a imagem para manter a força no mínimo e corrigir deriva térmica, mantendo contato com a amostra. No modo de contato, minimizar o set point. No modo de tocar, maximizar o set point. </li><li> Processar imagens por encaixando cada linha de digitalização para funções polinomiais de nivelamento. Executa a remoção linha para verificações que perdem contato com a membrana usando o software proprietário da empresa de fabricação de AFM. </li></ol></li><li> Força Spectroscopy <ol><li> Calibrar o cantilever seguindo as instruções de acordo com o protocolo do fabricante. A calibragem permite a conversão do sinal eléctrico dos fotodiodos de força (Figura 1B). <ol><li> Calibrar a sensibilidade da ponta para medir a deflexão de movimento piezo-z (em unidades de comprimento) em vez do sinal eléctrico em volts. <br /&gt; Nota: AFM detecta mudanças na deformação do cantilever usando um laser reflectida na parte traseira do braço de suporte. O laser atinge um fotodíodo que pode detectar a posição espacial do ponto de laser. Uma mudança na deflexão do braço de suporte, uma vez que se dobra quando em contacto com a amostra é detectada por este fotodíodo como &quot;de deflexão vertical&quot;, e isto é nas unidades de tensão. Uma vez que o braço de suporte é movido pelo piezo-z, a deflexão vertical está relacionado com o movimento na z-piezo. A relação entre a deflexão vertical e z movimento é chamado de sensibilidade e converte a tensão de distância. </li><li> Calcula-se a constante de mola cantilever usando o método de frequência de ruído térmico, geralmente incorporados no software AFM. Neste método, traçar a amplitude de vibração de ruído em relação à frequência de oscilação, a criação de uma trama densidade espectral de potência. Este gráfico irá mostrar um pico em torno da freqüência de ressonância. A freqüência em que o i amplitudeé a maior é a freqüência de ressonância. Ajustar uma função Lorentzian em torno do pico para calcular automaticamente a constante de mola pelo software. Alguns recursos úteis para a teoria do método de ruído térmico são dadas nas referências 27-30. </li></ol></li><li> Depois de imagiologia uma área da bicamada, seleccionar uma região x 5 mm 5 mm na bicamada para realizar espectroscopia de força. </li><li> Configure o AFM para que ele leva curvas de força em uma grade de que a região de 16 x 16. Isso resulta em 256 curvas força por região. O espaço entre dois pontos vizinhos deve ser suficiente para evitar que a área de membrana sendo sondado por um ponto coincidiria com o próximo ponto. Isto é dependente do raio da ponta. Uma distância de 100 nm entre dois pontos seria ideal. Divide x 5 uM a região 5 um de 16 x 16 em grade. Dependendo do tamanho da fase, pode-se seleccionar uma região mais pequena ou maior, e, em seguida, ajustar o tamanho da grelha em conformidade. </li><li> Definir deslocamento z piezo-a400 nm. Isso determina o alcance máximo do movimento do z-piezo. Ele deve ser suficientemente grande para garantir que o braço de suporte está totalmente retraída a partir da amostra entre as medições. </li><li> Definir velocidade de aproximação de 800 nm / seg e retrair a velocidade para 200 nm / seg. Utilize uma velocidade de aproximação entre 400 a 6000 nm / seg dependendo da composição da bicamada lipídica e da fase a ser estudado 6,16. </li><li> Depois de configurar todos os parâmetros, adquirir curvas força, pressionando o botão &quot;run&quot; do software AFM. </li><li> Salvar curvas de força como força vs. curvas de altura (uma medida do movimento z-piezo). Isso não leva em conta a curvatura do cantilever quando em contacto com a amostra. Durante a etapa de processamento de dados, o software permite a correção da AFM para cantilever dobrar para obter força vs. curvas de separação ponta-amostra (Figura 1C), o que dará valores adequados para a espessura da camada dupla. Os valores de correcção são geralmente incorporados na calibradoção, que são guardadas com cada curva de força. Calcular separação ponta-amostra subtraindo a deflexão vertical do movimento piezo a um determinado ponto. Nota: O pico na curva da força de aproximação (o valor da força vai para baixo, mesmo se o movimento cantilever ainda está no ciclo de abordagem) é a força de ruptura da membrana, enquanto que a diferença entre a posição do pico e a posição do ponto em que a força começa a levantar-se de novo fornece a espessura da membrana. </li><li> Adquirir, pelo menos, 500 curvas de força para cada condição para obter boas estatísticas. Traçar um histograma dos valores usando programas como origem ou MatLab, e se encaixam os histogramas para uma distribuição de Gauss para obter o pico e largura da distribuição. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

SLBS compostos de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram formadas em mica após adsorção vesícula e ruptura induzida por cloreto de cálcio. Esta composição de lípido separado em L e L o d fases. A fase L o é enriquecida em esf ingomielina e colesterol e é menos fluido / mais viscoso (Figura 1A) do que a fase L d 11. A separação de fase a partir de L o G d manifesta como estruturas circulares elevados acima da circundante (Figur...

Microscopia de força atómica (AFM) gera uma imagem de uma superfície de varrimento através de uma área da amostra, utilizando um braço de suporte com uma ponta muito afiada 1. O movimento do braço de suporte investiga a topologia de superfície da amostra. AFM tem sido amplamente aplicado para moléculas biológicas - incluindo proteínas, DNA e membranas, devido à sua versatilidade na análise de amostras fixadas no ar ou estado quase nativo em líquido 2-5. Para além da sua capacidade de imagiologia de alta resolução em escala nanométrica, o cantilever AFM actua como uma mola para sondar forças de interacção (adesão e repulsão) e as propriedades mecânicas da amostra 5,6. Isto é conhecido como espectroscopia de força. Neste modo, a sonda se aproxima primeiro da amostra e exerce uma força sobre ele, em seguida, é retraído até que perde o contacto com a amostra (Figura 1A). As curvas geradas mostram força em função da distância do braço de suporte, tanto para a aplicaçãobarata e retração. Várias propriedades, incluindo o módulo de elasticidade para medir a rigidez de um material, e as forças de adesão pode ser derivada. Bicamadas lipídicas suportados são membranas biológicas modelo que encontram-se no topo de um suporte sólido - geralmente mica, vidro de borosilicato, de sílica fundida, ou oxidado silício 7. Elas são preparadas utilizando várias técnicas, como a deposição de vesículas, método Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. Imagiologia AFM foi utilizado para seguir a formação destas camadas duplas suportados 10, e sondar diferentes estruturas formadas por membranas de diferentes composições 11-15. Execução de espectroscopia vigor em apoiadas resultados bicamadas em um pico na curva de abordagem. Este pico indica a força necessária para perfurar a camada dupla, e é chamada força de avanço. A espessura da bicamada pode também ser medido usando a curva de força 6. A força típica avanço de bilayersintervalo entre 1-50 nN 6. Estas propriedades dependem embalagem lípido (fase líquida ou gel) e da estrutura (comprimento da cadeia acilo e grau de insaturação) e alterado pelos agentes activos de membrana 16. A teoria por trás da ruptura foi explicada 17 e outros parâmetros experimentais, tais como maciez cantilever, raio de ponta e velocidade de aproximação também afetam a força de avanço 15,16,18. Espectroscopia de força foi usado para analisar as propriedades de diferentes fases lipídicas 11,19, dependente da composição alterações 12,20, bem como os efeitos de outras biomoléculas, tais como péptidos, sobre a estabilidade da membrana 21. A orientação plana de bicamadas suportados é vantajoso para a combinação de AFM com outros métodos tais como ressonância 22 e microscopia de fluorescência de plasma de superfície 11,19 para caracterizar melhor a estrutura e as propriedades das membranas. Este proto vídeo detalhadacol destina-se a preparar bicamadas lipídicas suportados usando deposição de vesículas e analisá-los com a AFM e espectroscopia de força. Enquanto vesículas de diferentes tamanhos podem ser utilizados para preparar bicamadas, este protocolo concentra-se em pequenos e grandes vesículas unilamelares. Bilayers suportados que separam em fase líquida ordenou (L o) e (L d) fases líquidas desordenados foram caracterizados 11,15. A membrana é composta de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM), e colesterol (Chol) a 2: 2: 1. Esta composição modelos as jangadas lipídicas, que são propostas para se comportar como plataformas importantes para o tráfico de proteína e de triagem, sinalização celular e outros processos celulares 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogenphosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), &gt;99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenphosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 24&amp;nbsp;x&amp;nbsp;60&amp;nbsp;mm, 1&amp;nbsp;mm thickness</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocks</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&amp;nbsp; Always handle mica with gloves or tweezers.</td></tr><tr><td>Laboratory Equipment Grease</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (&lt;a href=&quot;http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf&quot;&gt;Data sheet&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Silicon Nitride AFM Cantilever&amp;nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60&amp;nbsp;nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Bicamadas lipídicas constituídas suportados de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram fotografadas em AFM (Figura 2 CA). Devido à composição de lípido, foram observados SM / Chol-rico e L o DOPC-ricas fases G d. O perfil de altura a partir da imagem AFM pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da membrana. Ao olhar para o perfil de altura, a espessura da bicamada pode ser medido na presença de defeitos na membrana (Figura 2B), ou a diferença de alt...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K visualizações.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Vídeo: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Bioquímica

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Engenharia

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Bioengenharia

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Visualizing Solution Structure at Solid-Liquid Interfaces using Three-Dimensional Fast Force Mapping

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the solution conditions such as ion concentrations, pH, ligands, and trace additives, as well as the underlying crystallography and chemistry. In this context, three-dimensional fast force mapping (3D FFM) has emerged as a promising tool for investigating solution structure at interfaces. This capability is based on atomic force microscopy (AFM) and allows the direct visualization of interfacial regions in three spatial dimensions with sub-nanometer resolution. Here we provide a detailed description of the experimental protocol for acquiring 3D FFM data. The main considerations for optimizing the operating parameters depending on the sample and application are discussed. Moreover, the basic methods for data processing and analysis are discussed, including the transformation of the measured instrument observables into tip-sample force maps that can be linked to the local solution structure. Finally, we shed light on some of the outstanding questions related to 3D FFM data interpretation and how this technique can become a central tool in the repertoire of surface science.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizando a estrutura da solução em interfaces sólido-líquido usando mapeamento tridimensional de força rápida

Here, we present a protocol for using three-dimensional fast force mapping - an atomic force microscopy technique - for visualizing solution structure at solid-liquid interfaces with the subnanometer resolution by mapping the tip-sample interactions within the interfacial region.

Visualizando a estrutura da solução em interfaces sólido-líquido usando mapeamento tridimensional de força rápida

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the ...

Química

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Nanoindentação baseada em cantilever por microscopia de força atômica: medidas de propriedades mecânicas em nanoescala no ar e fluido

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

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