StickWRLD was made possible in part through funding provided to Dr. Ray by the Research Institute at Nationwide Children's Hospital, and by NSF grant DBI-1262457.

1. Software Download &amp; Instalação <ol><li> Use um computador tem um processador Intel Core i5 ou melhor processador com pelo menos 4 GB de RAM, e está executando o Mac OS X ou GNU / Linux (por exemplo, Ubuntu) OS. Além disso, Python 2.7.6 10 eo wxPython 2.8 11, SciPy 12 e 13 PyOpenGL bibliotecas python são necessários - download e instalar cada um de seus respectivos repositórios. </li><li> Baixe <a href="http://www.stickwrld.org" target="_blank">StickWRLD</a> como um arquivo zip contendo todos os scripts em Python relevantes. Faça o download do script &quot;fasta2stick.sh&quot; para converter padrão de ADN FASTA alinhamentos de sequências / proteína para o formato StickWRLD. </li><li> Extraia o arquivo e colocar a pasta StickWRLD resultando em seu Desktop. Coloque o script &quot;fasta2stick.sh&quot; no ambiente de trabalho também. </li></ol> 2. Prepare o Alinhamento <ol><li> Criar um alinhamento das sequências de proteínas utilizando qualquer standard software de alinhamento (por exemplo, ClustalX 14). Salve o alinhamento na área de trabalho em formato FASTA. </li><li> Abra o aplicativo de terminal no computador Mac ou GNU / Linux e navegue até a área de trabalho (o local do &quot;fasta2stick.sh&quot; script shell), digitando cd ~ / Desktop e pressionando retorno. Execute o script de &quot;fasta2stick.sh&quot; digitando ./fasta2stick.sh no terminal. Se o script não é executado, verifique se ele é executável - no tipo de terminal chmod + x fasta2stick.sh para fazer o script executável. </li><li> Siga as instruções na tela fornecidas pelo script para especificar o nome do arquivo de entrada (o arquivo criado em 1.2 acima) eo nome da saída desejada. Salve o arquivo de saída (que agora está no formato correto para StickWRLD) no ambiente de trabalho. </li></ol> 3. Lançar StickWRLD <ol><li> Navegar nos arquivos executáveis ​​StickWRLD pasta utilizando o terminal de applicção do computador Mac ou GNU / Linux. Por exemplo, se a pasta StickWRLD é na área de trabalho, digite cd ~ / Desktop / StickWRLD / exec no terminal. </li><li> Lançamento StickWRLD digitando python-32 stickwrld_demo.py no terminal. </li><li> Verifique se o painel de StickWRLD Data Loader é visível na tela (Figura 3). </li></ol> 4. Carregando a dados <ol><li> Carregue o alinhamento de seqüências convertido pressionando o &quot;Load Protein ...&quot; botão. </li><li> Selecione o arquivo criado no passo 3 acima e clique em &quot;Abrir&quot;. StickWRLD vai abrir várias janelas novas, incluindo &quot;Control StickWRLD&quot; (Figura 4) e &quot;StickWRLD - OpenGL&quot; (Figura 5). </li><li> Selecione o - janela &quot;StickWRLD OpenGL&quot;. Escolha &quot;Reset View&quot; no menu &quot;OpenGL&quot; para exibir a visualização StickWRLD padrão em um &quot;top-down&quot;Vista através do cilindro que representa os dados nas janelas OpenGL redimensionáveis ​​.. </li></ol> 5. Opções de Visualização <ol><li> Marque as caixas para &quot;Etiquetas coluna&quot; e &quot;Etiquetas da bola&quot; no painel &quot;Controle StickWRLD&quot; (Figura 4) para apresentar valores para colunas e bolas. </li><li> Desmarque a caixa de &quot;Edges coluna&quot; no painel &quot;Controle StickWRLD&quot; para ocultar as linhas de borda coluna. </li><li> Defina o &quot;Espessura Coluna&quot; a 0.1 no painel &quot;Controle StickWRLD&quot; para desenhar uma linha fina através das colunas, tornando-o mais fácil de navegar a visualização em 3D. Pressione Return para aceitar a alteração. </li><li> Repor a vista no &quot;StickWRLD - OpenGL&quot; janela como no passo 5.3 acima, em seguida, pressione o botão &quot;tela cheia&quot; para maximizar a vista. </li></ol> 6. Navigation <ol><li> Rode o ecrã StickWRLD 3D pressionando o botão esquerdo do mouse while movendo o mouse em qualquer direção. </li><li> Aumentar a exibição StickWRLD 3D pressionando o botão direito do mouse enquanto move o mouse para cima ou para baixo. </li></ol> 7. Encontrar interposição Dependências (DIP) <ol><li> Navegue pela vista panorâmica e zoom pelo conforme descrito na etapa 6. resíduos co-evoluindo excedam os requisitos de limiar de ambos p e residual são ligados através de linhas de bordo como visto na Figura 6. Se houver muitas ou poucas arestas que ligam os resíduos, altere o Residual limiar (no painel &quot;Controle StickWRLD&quot;) para mostrar menos, ou mais, bordas. </li><li> Aumentar o limite residual no Painel de Controle do StickWRLD até há linhas de bordo IPD são mostrados e lentamente rampa para baixo até que as relações aparecer. Continue aumentando o residual até que você tenha um número suficiente de relacionamentos para examinar. </li><li> Identificar as relações que envolvem tanto resíduos de interesse conhecidos (por exemplo, dentro de um motivo ou ligação / functional local) ou resíduos que são distai um ao outro dentro do alinhamento (o que sugere que eles são proximal na proteína dobrada) </li></ol> 8. selecionar e salvar Apreciação <ol><li> Usando o comando + clique esquerdo em todas as bordas de interesse. O painel de controle StickWRLD indicará as colunas e se conectar resíduos específicos, por exemplo, &quot;(124 | G) (136 | H)&quot; (Figura 7). As linhas sólidas representam associações positivas; linhas tracejadas representam associações negativas. </li><li> Pressione o botão &quot;Arestas de saída&quot; no painel &quot;Controle StickWRLD&quot; para salvar um arquivo no formato de texto simples (edge_residual.csv) de todas as arestas visíveis, incluindo os resíduos se juntaram e seus valores residuais reais, no / StickWRLD / exec / diretório. </li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVL/StickWRLD:+analyzing+structural+constraints+using+interpositional+dependencies+in+biomolecular+sequence+alignments.">MAVL/StickWRLD: analyzing structural constraints using interpositional dependencies in biomolecular sequence alignments.</a> Nucleic acids research. 34, W133-W136 (2006).</li><li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVL/StickWRLD+for+protein:+visualizing+protein+sequence+families+to+detect+non-consensus+features.">MAVL/StickWRLD for protein: visualizing protein sequence families to detect non-consensus features.</a> Nucleic acids research. 33, W315-W319 (2005).</li><li>Ray, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Visual+Analytics+approach+to+identifying+protein+structural+constraints.">A Visual Analytics approach to identifying protein structural constraints.</a> IEEE. , 249-250 (2010).</li><li>Wheeler, T. J., Clements, J., Finn, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skylign:+a+tool+for+creating+informative,+interactive+logos+representing+sequence+alignments+and+profile+hidden+Markov+models.">Skylign: a tool for creating informative, interactive logos representing sequence alignments and profile hidden Markov models.</a> BMC bioinformatics. 15, 7 (2014).</li><li>Perrier, V., Burlacu-Miron, S., Bourgeois, S., Surewicz, W. K., Gilles, A. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

StickWRLD tem sido utilizado com sucesso para identificar tais DIP no domínio da tampa 16 adenilato-quinase, assim como bases de ADN associados no dependente de rho terminadores 9, e uma nova especificidade de splice-site na Archaea ARNt intrão 6 locais-alvo da endonuclease. Estes IPDs não eram detectáveis ​​através de um exame direto dos alinhamentos. StickWRLD exibe cada posição de um alinhamento como uma coluna de 20 &quot;esferas&quot;, em que cada esfera representa um dos 20 resíduos de aminoácidos e o tamanho da esfera indica a frequência de ocorrência de que resíduo em particular dentro dessa coluna (Figura 4). As colunas são dispostas de um cilindro, com linhas de aresta de ligação em diferentes resíduos de colunas (indicando um DPI). Estas linhas de bordo só são desenhados se os resíduos correspondentes são covarying a uma frequência superando tanto o valor de p (significância) e (esperados) - observados os limites residuais. Detecção de resíduos co-ocorrência interdependentes, ou IPDs, em regiões distais de um alinhamento de DNA ou sequência de proteína é difícil o uso de ferramentas de alinhamento de sequências padrão 6. Embora tais ferramentas gerar um consenso, ou motivo, seqüência, esse consenso é, em muitos casos, um simples cálculo da média do governo de maioria e não transmite relações de co-variação que podem formar um ou mais sub-temas - grupos de resíduos que tendem a co-evoluir. Mesmo modelos HMM, que são capazes de detectar dependências vizinhos, não pode com precisão modelo motivos de sequência com IPDs distal 5. O resultado é que o consenso calculados podem, de facto, ser uma sequência de &quot;sintético&quot; não encontrada na natureza - e proteínas modificadas com base em tais consenso computacional não podem, de facto, ser o ideal. Na verdade, a Pfam HMM para ADK iria sugerir que uma proteína quimérica contendo a metade do motivo tetracisteï¿½a, e metade do H, S, D, T motivo, é funcionalmente tão aceitávelcomo qualquer ADK realmente existente. Este não é o caso, tais como quimeras (e muitos outros blendings destes motivos) são cataliticamente morto 4,19. Ao olhar para as correlações, é crítico que o limiar residual ser ajustado para permitir a descoberta de correlações relevantes, definindo o limite acima do nível em que quaisquer arestas são vistas e, em seguida, gradualmente aumentando o limiar de volta para baixo. Isto garante que apenas as bordas mais significativos são considerados inicialmente. Uma abordagem alternativa é começar com o limite residual definir extremamente baixo. Isto resulta na exposição de todas as arestas significativas. A partir daqui o limite residual pode ser aumentada lentamente, permitindo bordas para cair fora até padrões emergem. Enquanto esta abordagem é menos útil quando se olha para a inclusão de nós específicos (por exemplo, aplicação do conhecimento do domínio), que permite a descoberta de relações inesperadas utilizando StickWRLD como uma visual ferramenta analítica para descobrir padrões emergentes na visualização de dados. StickWRLD é limitada principalmente pela memória disponível do sistema no qual ele é administrado, bem como a resolução do dispositivo de exibição. Embora não haja um limite teórico para o número de pontos de dados StickWRLD pode examinar, e sequências até 20.000 posições foram testadas, na prática, tem um melhor desempenho com StickWRLD sequências até cerca de 1.000 posições. A principal vantagem de StickWRLD reside na sua capacidade para identificar os grupos de resíduos que covary um com o outro. Esta é uma vantagem significativa sobre a abordagem tradicional da sequência de consenso estatística, que é uma média estatística simples e não leva em conta a co-evolução. Embora em alguns casos resíduos covarying pode ser simplesmente um artefato de filogenia, mesmo estes resíduos têm resistido ao &quot;teste de seleção&quot;, e como tal não são susceptíveis de prejudicar a functionalidade de qualquer proteína manipulada para incluí-los. Enquanto utilizando StickWRLD para identificar DIP em uma sequência de ADN ou proteína canónica consenso / motivo antes variantes sintéticas engenharia irá reduzir o potencial de erro e suporta optimização rápida da função, deve-se notar que StickWRLD pode ser utilizado como uma ferramenta de identificação de correlação generalizada e não está limitada exclusivamente a dados de proteínas. StickWRLD pode ser usado para descobrir visualmente a co-ocorrência de quaisquer variáveis ​​em qualquer conjunto de dados codificados adequadamente.

Alinhamentos de proteínas têm sido muito utilizadas para avaliar a semelhança de resíduos de uma família de proteínas. Frequentemente as características mais interessantes de uma proteína (por exemplo, sítios de ligação catalíticos ou outros) são o resultado de proteína dobrar trazendo regiões distais da sequência linear em contato, e como resultado dessas regiões aparentemente não relacionados no alinhamento tendem a evoluir e mudar em de forma coordenada. Em outros casos, a função de uma proteína pode estar dependente da sua assinatura electrostático, e mutações que afectam o dipolo electrónico são compensadas por alterações resíduos carregados distantes. Efeitos alostéricos também pode induzir de longo alcance dependências sequenciais e espaciais entre identidades de resíduos. Independentemente da sua origem, esses covariações funcionalmente necessários de resíduos - dependências inter-posicionais (DIP) - pode não ser óbvio com exame visual do alinhamento (Figura 1). Identificação de DIP - bem como deque resíduos específicos dentro desses cargos tendem a covary como uma unidade - pode revelar pistas importantes sobre os processos de dobramento de proteínas e a formação de sítios funcionais. Esta informação pode então ser utilizada para optimizar as proteínas sintéticas (artificiais) em termos de estabilidade térmica e actividade. Ele tem sido conhecido que nem todas as mutações pontuais em direção a um consenso proporcionar uma melhor estabilidade ou atividade. Mais recentemente, proteínas concebido para tirar vantagem de DIP conhecidas na sua sequência foram mostrados para resultar numa maior actividade do que a mesma proteína concebido estritamente de consenso 1,2 (manuscrito em preparação), semelhante à ideia de estabilização mutações pontuais 3. Infelizmente, os modelos tradicionais de construção de consenso (por exemplo, a regra da maioria), apenas capturar IPDs por acidente. Métodos de consenso e posição de pontuação específica Matrix são ignorantes e só IPDs &quot;correctamente&quot; incluí-los em modelos, quando os resíduos dependentestambém são os resíduos mais populares para aquelas posições na família. Modelos de cadeia de Markov pode capturar IPDs quando estão sequencialmente proximal, mas a sua implementação típica ignora tudo, exceto vizinhos imediatos seqüenciais, e até mesmo no seu melhor, cálculos Hidden Markov Model (ver Figura 2) tornar-se intratável quando dependências são separados na seqüência por mais de uma dúzia de posições 4. Uma vez que estes IPDs essencialmente formar &quot;sub-temas&quot; que não pode ser prevista por simples &quot;regra da maioria&quot; ou modelos de consenso, mesmo baseados em HMM 5,6 o resultado pode ser um &quot;consenso&quot; biologicamente inválido que não só é nunca visto na natureza, mas é menos viável do que qualquer proteína existente. Os sistemas baseados em campos aleatórios de Markov, tais como GREMLIN 7, tentar ultrapassar estes problemas. Adicionalmente enquanto que as técnicas biológicas / bioquímicas sofisticadas, tais como não-contíguo 3,8 recombinação pode ser usado para identify elementos essenciais de proteínas por região, eles exigem tempo considerável e bancada de trabalho de precisão à base de um único par de ser alcançado. StickWRLD 9 é um programa baseado em Python que cria uma representação em 3D interativa de um alinhamento proteína que faz IPDs clara e fácil de entender. Cada posição no alinhamento está representada como uma coluna no visor, em que cada coluna é constituída por uma pilha de esferas, um para cada um dos 20 aminoácidos que podem estar presentes em que posição dentro do alinhamento. O tamanho de esfera é dependente da frequência da ocorrência dos aminoácidos, de tal modo que o utilizador pode recolher imediatamente o resíduo de consenso ou a distribuição relativa de aminoácidos dentro dessa posição olhando simplesmente para o tamanho das esferas. As colunas que representam cada posição são enrolados em torno de um cilindro. Isto dá cada esfera que representa uma possível aminoácido em cada posição no alinhamento, um &quot;linha de visão&quot; clarapara todas as outras possibilidades de aminoácidos em todas as outras posições. Antes de visualização, StickWRLD calcula a força da correlação entre todas as combinações possíveis de resíduos para identificar a IPDs 9. Para representar DIP, são desenhadas linhas entre os resíduos que são co-evolução em maior ou menor do que seria de esperar se os resíduos presentes nas posições eram independentes (DIP). Não só esta visualização mostra que posições de sequência interagir evolutivamente, mas como as linhas de borda IPD são desenhadas entre as esferas de aminoácidos em cada coluna, o usuário pode determinar rapidamente quais aminoácidos específicos tendem a ser co-evoluindo em cada posição. O utilizador tem a capacidade de rodar e explorar a estrutura IPD visualizado, bem como dinamicamente alterar os limites estatísticos que controlam a visualização das correlações, fazendo StickWRLD uma ferramenta poderosa para a descoberta DIP. Aplicações como GREMLIN 7 similarly exibir informações relacional complexa entre os resíduos -, mas essas relações são computados via modelos de Markov mais tradicionais, que não são projetados para determinar quaisquer relações condicionais. Como tal, estes são capazes de serem apresentados como projecções 2D. Em contrapartida, StickWRLD pode calcular e exibir dependências condicionais multi-nó, que pode ser ofuscado se rendido como um gráfico 2D (um fenômeno conhecido como oclusão borda). Visualização em 3D do StickWRLD também tem várias outras vantagens. Ao permitir que os usuários manipulem as visuais -, rodar e zoom - características que podem ser ofuscadas ou unintuitive em uma representação 2D pode ser mais facilmente visto no cilindro 3D de StickWRLD. StickWRLD é essencialmente uma ferramenta visual analytics, aproveitando o poder da capacidade de reconhecimento de padrões do cérebro humano para ver padrões e tendências, ea capacidade de explorar os dados a partir de várias perspectivas se presta a isso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mac or Ubuntu OS computer</td>
			<td>Various</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any Mac or linux (e.g. Ubuntu) computer capable of running python &#38; associated shell scripts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python programming language</td>
			<td>python.org</td>
			<td>NA</td>
			<td>Python version 2.7.6 or greater recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wxPython library</td>
			<td>wxpython.org</td>
			<td>NA</td>
			<td>Latest version recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SciPy library</td>
			<td>scipy.org</td>
			<td>NA</td>
			<td>Latest version recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyOpenGL library</td>
			<td>pyopengl.sourceforge.net</td>
			<td>NA</td>
			<td>Latest version recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StickWRLD Python scripts</td>
			<td>NCH BCCM</td>
			<td>NA</td>
			<td>Available from http://www.stickwrld.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fasta2stick.sh file converter</td>
			<td>NCH BCCM</td>
			<td>NA</td>
			<td>Available from http://www.stickwrld.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein and/or DNA sequence data</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Samples available at http://www.stickwrld.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of synthetic proteins: identification of interpositional dependencies indicating structurally and/or functionally linked residues

Alinhamentos de proteína são comumente utilizados para avaliar a semelhança de resíduos de proteínas, e a sequência de consenso derivada utilizado para identificar as unidades funcionais (por exemplo, domínios). Os modelos tradicionais de construção de consenso não levam em conta as dependências de interposição - funcionalmente necessário co-variação de resíduos que tendem a aparecer simultaneamente ao longo da evolução e do outro lado da árvore phylogentic. Estas relações podem revelar pistas importantes sobre os processos de dobragem de proteínas, termoestabilidade, e a formação de sítios funcionais, que por sua vez podem ser usados ​​para informar a engenharia de proteínas sintéticas. Infelizmente, essas relações essencialmente formar sub-motivos que não pode ser prevista por simples &quot;regra da maioria&quot; ou modelos de consenso, mesmo baseados em HMM, eo resultado pode ser um &quot;consenso&quot; biologicamente inválido que não só é nunca visto na natureza, mas é menos viável do que qualquer proteína existente. Nós desenvolvemos uma uma visuaisferramenta alytics, StickWRLD, que cria uma representação em 3D interativo num alinhamento de proteínas e claramente mostra covarying resíduos. O usuário tem a capacidade de panorâmica e zoom, bem como alterar dinamicamente o limiar estatístico subjacente à identificação dos covariantes. StickWRLD foi anteriormente utilizado com sucesso para identificar resíduos covarying funcionalmente exigidas em proteínas tais como a adenilato-quinase e de sequências de ADN, tais como locais-alvo da endonuclease.

StickWRLD foi usado anteriormente para detectar dependências de interposição (DIP) entre os resíduos em ambos os 3 DNA e proteínas 15-17 alinhamentos. Estes resíduos de co-evolução, enquanto muitas vezes distai de uma outra no alinhamento de sequências, são muitas vezes proximal para uma outra na proteína dobrada. StickWRLD permite a rápida descoberta de co-ocorrência específica do resíduo em tais locais, por exemplo., Uma alanina na posição &quot;X&quot; é fortemente correlacionada com uma treonina na posição de &quot;y&quot;. Estas correlações podem ser indicativos de relações estruturais demonstráveis, e tipicamente são os locais que, por necessidade, co-evoluem. StickWRLD é capaz de detectar esses relacionamentos, mesmo quando mais &quot;tradicional&quot; abordagens usando HMMs para descrever motivos falhar. Por exemplo, a análise do alinhamento PFAM do domínio ADK tampa usando StickWRLD revela uma forte correlação positiva entre cisteínas (C) nas posições 4 e 8 e uma coordenadapar de C nas posições 35 e 38. Ao mesmo tempo, StickWRLD mostrou uma forte relação positiva semelhante entre histidina (H) e serina (S), a 4 e 8, com fortes relações negativas entre estes eo quarteto C a 4, 8, 35, e 38, e uma forte correlação positiva com o ácido aspártico (D) e treonina (T) nas posições 35 e 38, respectivamente. Existem IPDs adicionais entre o H, S, D, T motivo e uma T e G na posição **** 10 e 29 em subtilis b **** destacando o carácter condicional destas IPDs - o motivo tetracisteï¿½a não &quot;cuidado&quot; sobre as identidades nessas duas posições, enquanto o H hidrofílico, S, D, T tríade exige que os resíduos específicos nestas posições quase absolutamente. Estes dois motivos resíduos dependente da posição completamente diferente pode cumprir o mesmo papel a tampa ADK. Como pode ser visto na Figura 6, um grande aglomerado de DIP, incluindo uma associação de 3-nó entre G (glicina) na posição 132, Y (tirosina) na posição 135, e um P (ProLiNE) na posição 141, é visível no primeiro plano (Figura 6A). Na Figura 6B, o ponto de vista tem sido desviada para posicionar o utilizador ligeiramente acima do cilindro, revelando uma IPD entre um H (histidina) na posição 136 e um M (metionina) na posição 29, 107 resíduos distante. Um motivo PFAM HMM-derivado do mesmo domínio (Figura 2), por sua vez, não só não detecta estes como especificamente variantes motivo co-occuring, mas também define os grupos globais em um esquema biologicamente sem suporte 16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. &quot;Subway Map&quot; representação do B. subtilis adenosina quinase estrutura de domínio (ADK) Lid. As setas indicam IPDs identificados no alinhamento PFAM de ADK domínio Lid por StickWRLD. StickWRLD é capaz de identificar corretamente IPDs dentro de um cluster oresíduos de f que estão em estreita proximidade na proteína dobrada. De particular interesse são os pares T e G nas posições 9 e 29, que formam apenas uma DIP, quando o tétrade de resíduos em 4, 7, 24, e 27 não seja C, C, C, C). Números dos resíduos apresentada representa B. subtilis posições de alinhamento de posição e não Pfam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Skylign 18 Hidden Markov Model (HMM) Logo Seqüência para o domínio ADK tampa. Enquanto HMMs são ferramentas poderosas para determinar as probabilidades em cada posição, bem como a contribuição de cada site para o modelo global, a independência posicional de HMMs torna- inadequados para detectar IPDs. Este modelo não sugerir qualquer um dosdependências visto nas representações StickWRLD (Figura 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig3.jpg" /> Figura 3. O StickWRLD Data Loader. Os usuários podem escolher a partir de dados de demonstração existentes ou carregar os seus próprios dados na forma de DNA ou sequência de proteína alinhamentos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. A janela Controle de StickWRLD. O painel de controle permite ao usuário alterar várias propriedades de vista, bem como regular os limiares que controlam a exibição de linhas de bordo, indicando relações entre resíduos (DIP). Circulado em vermelho são os padrões que normalmente precisam de t<html> o ser ajustado para uma melhor visualização de qualquer conjunto de dados. O valor residual define o limiar de (observado o esperado) para os quais linhas conector / associação são desenhados. Os controles para Rótulos de coluna e Bola de controlar ou não a posição da coluna e os valores de resíduos (por exemplo, &quot;A&quot; para a arginina) são exibidos. A coluna de borda alterna controle de linha e fora da exibição de linhas de borda conectando colunas - para conjuntos de dados densos isso é melhor desligado. Os controles de coluna de espessura ou não a própria coluna é exibida -. ​​Definir este para um valor muito pequeno (por exemplo, 0.1) irá desenhar uma linha através das esferas na coluna, tornando-se fácil distinguir as colunas de um outro <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig4highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> &quot;width =&quot; 600 ghres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. visão inicial da janela StickWRLD OpenGL com o domínio tampa conjunto de dados proteína adenilatoquinase carregado. A perspectiva inicial olha &quot;para baixo&quot; através do cilindro composto pelas posições de alinhamento de sequências. O usuário pode girar o cilindro usando esquerdo do mouse clique e arraste, e zoom in / out usando botão direito do mouse clique e arraste-. A visão inicial é bastante densa, porque a exibição padrão mostra mesmo pequenas taxas de co-evolução. Para muitas proteínas, nesta configuração, módulos distintos podem ser detectados, mas mesmo em densamente co-evoluindo proteínas a tela pode ser rapidamente e de forma interativa simplificados para encontrar as DIP mais importantes usando a interface StickWRLD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior este valor.</a> &quot;width =&quot; 700 ghres.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Opinião do close up de uma visualização StickWRLD da proteína domínio tampa adenilatoquinase. Aqui nós mudamos o padrão residual para 0,2. Isto aumenta o limiar para a exibição de arestas de inter-resíduos, mostrando menos arestas. As arestas que permanecem indicam IPDs fortemente associados. Além disso, o ponto de vista tem sido rodado e ampliado para permitir uma melhor visualização das bordas. (A) Um grande conjunto de DIP é visível no primeiro plano, incluindo uma associação de 3-nó entre G (glicina) na posição 132, Y (tirosina) na posição 135, e um P (prolina) na posição 141. (B) A vista foi desviada para posicionar o usuário ligeiramente acima do cilindro, revelando uma IPD entre um H (histidina) na posição 136 e um M (metionina) na posição 29, 107 resíduos distante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52878/52878fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52878/52878fig7.jpg" /> Figura 7. Janela do Controle StickWRLD inferior direito vista da informação. CTRL + clique esquerdo em um objeto (por exemplo, esfera ou ponta) na janela de OpenGL exibe as informações para o objeto no canto inferior direito da janela do Controle StickWLRD. Aqui vemos a informação para uma vantagem IPD entre uma metionina na posição 29 e uma histidina na posição 136.

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Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.

Otimização de proteínas sintéticas: Identificação de interposição Dependências Indicating Estruturalmente e / ou resíduos funcionalmente ligadas

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

optimization-synthetic-proteins-identification-interpositional

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.2K visualizações.  The Research Institute at Nationwide Children's Hospital. Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.

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Towards Biomimicking Wood: Fabricated Free-standing Films of Nanocellulose, Lignin, and a Synthetic Polycation

Woody materials are comprised of plant cell walls that contain a layered secondary cell wall composed of structural polymers of polysaccharides and lignin. Layer-by-layer (LbL) assembly process which relies on the assembly of oppositely charged molecules from aqueous solutions was used to build a freestanding composite film of isolated wood polymers of lignin and oxidized nanofibril cellulose (NFC). To facilitate the assembly of these negatively charged polymers, a positively charged polyelectrolyte, poly(diallyldimethylammomium chloride) (PDDA), was used as a linking layer to create this simplified model cell wall. The layered adsorption process was studied quantitatively using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and ellipsometry. The results showed that layer mass/thickness per adsorbed layer increased as a function of total number of layers. The surface coverage of the adsorbed layers was studied with atomic force microscopy (AFM). Complete coverage of the surface with lignin in all the deposition cycles was found for the system, however, surface coverage by NFC increased with the number of layers. The adsorption process was carried out for 250 cycles (500 bilayers) on a cellulose acetate (CA) substrate. Transparent free-standing LBL assembled nanocomposite films were obtained when the CA substrate was later dissolved in acetone. Scanning electron microscopy (SEM) of the fractured cross-sections showed a lamellar structure, and the thickness per adsorption cycle (PDDA-Lignin-PDDA-NC) was estimated to be 17 nm for two different lignin types used in the study. The data indicates a film with highly controlled architecture where nanocellulose and lignin are spatially deposited on the nanoscale (a polymer-polymer nanocomposites), similar to what is observed in the native cell wall.

The objective of this research was to form synthetic plant cell wall tissue using layer-by-layer assembly of nanocellulose fibrils and isolated lignin assembled from dilute aqueous suspensions.&#160; Surface measurement techniques of quartz crystal microbalance and atomic force microscopy were used to monitor the formation of the polymer-polymer nanocomposite material.

Rumo Biomimicking Madeira: Fabricados free-standing Filmes de nanocellulose, lignina, e uma policátion sintético

Woody materials are comprised of plant cell walls that contain a layered secondary cell wall composed of structural polymers of polysaccharides and ...

Química

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

This article will focus on developing polymer coated surfaces for long-term, stable culture of stem cell derived human hepatocytes.

Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. The most common techniques utilized are imaging modalities such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Topography (PET), and Computed Topography (CT) and are optimal for understanding the physical structure of the disease but can only be performed once every four to six weeks due to the use of imaging agents and overall cost. With this in mind, the development of &#8220;point of care&#8221; techniques, such as biosensors, which evaluate the stage of disease and/or efficacy of treatment in the clinician&#8217;s office and do so in a timely manner, would revolutionize treatment protocols.1 As a means to exploring ferrocene based biosensors for the detection of biologically relevant molecules2, methods were developed to produce ferrocene-biotin bio-conjugates described herein. This report will focus on a biotin-ferrocene-cysteine system that can be immobilized on a gold surface.

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Metodologia sintética para Asymmetric Ferroceno Derivados Sistemas Bio-conjugadas via Metodologia base de resina em Fase Sólida

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Cortina Fluxo Coluna: Optimização da Eficiência e Sensibilidade

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ethylene-propylene rubber, grafted with maleic anhydride, is thermo-reversibly cross-linked in two steps. The pending anhydride moieties are first modified with furfurylamine to graft furan groups to the rubber backbone. These pendant furan groups are then cross-linked with a bis-maleimide via a Diels-Alder coupling reaction. Both reactions can be performed under a broad range of experimental conditions and can easily be applied on a large scale. The material properties of the resulting Diels-Alder cross-linked rubbers are similar to a peroxide-cured ethylene/propylene/diene rubber (EPDM) reference. The cross-links break at elevated temperatures (&#62; 150 &#176;C) via the retro-Diels-Alder reaction and can be reformed by thermal annealing at lower temperatures (50-70 &#176;C). Reversibility of the system was proven with infrared spectroscopy, solubility tests and mechanical properties. Recyclability of the material was also shown in a practical way, i.e., by cutting a cross-linked sample into small parts and compression molding them into new samples displaying comparable mechanical properties, which is not possible for conventionally cross-linked rubbers.

A simple two-step approach involving rubber modification and cross-linking yields fully reworkable, elastic rubber products.

A preparação e propriedades de termo-reversível reticulada Química Rubber Via Diels-Alder

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Synthesis of Platinum-nickel Nanowires and Optimization for Oxygen Reduction Performance

Platinum-nickel (Pt-Ni) nanowires were developed as fuel cell electrocatalysts, and were optimized for the performance and durability in the oxygen reduction reaction. Spontaneous galvanic displacement was used to deposit Pt layers onto Ni nanowire substrates. The synthesis approach produced catalysts with high specific activities and high Pt surface areas. Hydrogen annealing improved Pt and Ni mixing and specific activity. Acid leaching was used to preferentially remove Ni near the nanowire surface, and oxygen annealing was used to stabilize near-surface Ni, improving durability and minimizing Ni dissolution. These protocols detail the optimization of each post-synthesis processing step, including hydrogen annealing to 250 &#176;C, exposure to 0.1 M nitric acid, and oxygen annealing to 175 &#176;C. Through these steps, Pt-Ni nanowires produced increased activities more than an order of magnitude than Pt nanoparticles, while offering significant durability improvements. The presented protocols are based on Pt-Ni systems in the development of fuel cell catalysts. These techniques have also been used for a variety of metal combinations, and can be applied to develop catalysts for a number of electrochemical processes.

&#160; The protocol describes the synthesis and electrochemical testing of platinum-nickel nanowires. Nanowires were synthesized by the galvanic displacement of a nickel nanowire template. Post-synthesis processing, including hydrogen annealing, acid leaching, and oxygen annealing were used to optimize nanowire performance and durability in the oxygen reduction reaction.

Síntese de nanofios de níquel e platina e otimização de desempenho de redução do oxigênio

Platinum-nickel (Pt-Ni) nanowires were developed as fuel cell electrocatalysts, and were optimized for the performance and durability in the oxygen ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

Cor de teste local como uma ferramenta presuntiva para a detecção rápida de Cathinones sintético

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

Caracterização de Polímeros Sintéticos via Espectrometria de Massa por Ionização a Laser com Matriz Assistida por Tempo de Voo (MALDI-TOF)

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

A Facile Synthetic Method to Obtain Bismuth Oxyiodide Microspheres Highly Functional for the Photocatalytic Processes of Water Depuration

Bismuth oxyhalide (BiOI) is a promising material for sunlight-driven-environmental photocatalysis. Given that the physical structure of this kind of materials is highly related to its photocatalytic performance, it is necessary to standardize the synthetic methods in order to obtain the most functional architectures and, thus, the highest photocatalytic efficiency. Here, we report a reliable route to obtain BiOI microspheres via the solvothermal process, using Bi(NO3)3 and potassium iodide (KI) as precursors, and ethylene glycol as a template. The synthesis is standardized in a 150 mL autoclave, at 126 &#176;C for 18 h. This results in 2-3 &#181;m-sized mesoporous microspheres, with a relevant specific surface area (61.3 m2/g). Shortening the reaction times in the synthesis results in amorphous structures, while higher temperatures lead to a slight increase in the porosity of the microspheres, with no effect in the photocatalytic performance. The materials are photo-active under UV-A/visible light irradiation for the degradation of the antibiotic ciprofloxacin in water. This method has demonstrated to be effective in interlaboratory tests, obtaining similar BiOI microspheres in Mexican and Chilean research groups.

This article describes a synthetic method to obtain bismuth oxyiodide microspheres, which are highly functional to perform the photocatalytic removal of organic pollutants, such as ciprofloxacin, in water under UV-A/visible light irradiation.

Um método sintético Facile para obter Oxyiodide de bismuto microesferas altamente funcional para os processos de Photocatalytic de depuração de água

Bismuth oxyhalide (BiOI) is a promising material for sunlight-driven-environmental photocatalysis. Given that the physical structure of this kind of ...

Ultrafast Lignin Extraction from Unusual Mediterranean Lignocellulosic Residues

Pretreatment is still the most expensive step in lignocellulosic biorefinery processes. It must be made cost-effective by minimizing chemical requirements as well as power and heat consumption and by using environment-friendly solvents. Deep eutectic solvents (DESs) are key, green, and low-cost solvents in sustainable biorefineries. They are transparent mixtures characterized by low freezing points resulting from at least one hydrogen bond donor and one hydrogen bond acceptor. Although DESs are promising solvents, it is necessary to combine them with an economic heating technology, such as microwave irradiation, for competitive profitability. Microwave irradiation is a promising strategy to shorten the heating time and boost fractionation because it can rapidly attain the appropriate temperature. The aim of this study was to develop a one-step, rapid method for biomass fractionation and lignin extraction using a low-cost and biodegradable solvent. 
In this study, a microwave-assisted DES pretreatment was conducted for 60 s at 800 W, using three kinds of DESs. The DES mixtures were facilely prepared from choline chloride (ChCl) and three hydrogen-bond donors (HBDs): a monocarboxylic acid (lactic acid), a dicarboxylic acid (oxalic acid), and urea. This pretreatment was used for biomass fractionation and lignin recovery from marine residues (Posidonia leaves and aegagropile), agri-food byproducts (almond shells and olive pomace), forest residues (pinecones), and perennial lignocellulosic grasses (Stipa tenacissima). Further analyses were conducted to determine the yield, purity, and molecular weight distribution of the recovered lignin. In addition, the effect of DESs on the chemical functional groups in the extracted lignin was determined by Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. The results indicate that the ChCl-oxalic acid mixture affords the highest lignin purity and the lowest yield. The present study demonstrates that the DES-microwave process is an ultrafast, efficient, and cost-competitive technology for lignocellulosic biomass fractionation.

Deep eutectic solvent-based, microwave-assisted pretreatment is a green, fast, and efficient process for lignocellulosic fractionation and high-purity lignin recovery.

Extração de Lignina ultrarrápida de resíduos lignocelúsicos incomuns do Mediterrâneo

Pretreatment is still the most expensive step in lignocellulosic biorefinery processes. It must be made cost-effective by minimizing chemical requirements ...