Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

O protocolo corrente foi utilizado com sucesso para gerar full-length clones de ADNc infecciosos de duas estirpes diferentes (CNU / LP2 27 e 14 SA -14-2 28) do JEV, um flavivírus cujo ADNc funcional demonstrou ser inerentemente difícil de construir e propagar por causa da toxicidade da célula hospedeira e a instabilidade genética do ADNc clonado 8,74-76 Este protocolo envolve três componentes principais:. em primeiro lugar, maximizando a síntese / amplificação de uma cópia fiel ADNc do ARN viral de alta fidelidade utilizando transcriptase reversa / ADN-polimerase; Em segundo lugar, a clonagem da região prM-E viral contendo sequências de codificação tóxicos (dados não publicados) 74,77,78 em um nível muito baixo número de cópias do vector BAC de cDNA inicial de subclonagem para os passos de comprimento completo de ADNc de montagem final; e em terceiro lugar, utilizando um vector de clonagem BAC que pode acomodar um ADN estranho com uma dimensão média de 120-350 kb, que, aparentemente, 19-21 tolera maiores ADN InSerts do que os outros vectores de clonagem. Esta abordagem de clonagem será geralmente aplicável a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva, particularmente aqueles com um grande genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Geração de um ADNc de clone infeccioso é um passo chave no desenvolvimento de um sistema de genética inversa de vírus de ARN, especialmente para vírus de ARN de cadeia positiva, porque o seu genoma actua como ARNm viral que é traduzido em proteínas por ribossomas da célula hospedeira. Assim, a replicação virai pode ser iniciada pela introdução de um genoma de comprimento molécula de ARN derivado de ADNc numa célula hospedeiro susceptível. A disponibilidade de um clone infeccioso de cDNA JEV, quando combinado com a tecnologia de ADN recombinante, tem aumentado a compreensão dos vários aspectos do ciclo de vida virai, a nível molecular, tais como a expressão de genes e replicação do genoma 73,79. 63,64 Além disso, uma de comprimento completo JEV clone de ADNc tem provado ser uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de vacinas antivirais 28 e vectores de entrega de genes. &lt;sup&gt; 80,81 Tal como acontece com todos os vírus de ARN de cadeia positiva, existem vários passos críticos na construção de um ADNc funcional de confiança para o JEV a partir do qual os ARN altamente infecciosas podem ser sintetizados in vitro. Idealmente, a sequência dos ARN transcritos sintéticos a partir de um clone do ADNc de comprimento completo deve ser idêntico ao do ARN genómico viral, particularmente os 5&#39;- e 3&#39;-terminal de sequências que são necessárias para a iniciação da replicação de ARN viral . 60-62 No protocolo actual, o autêntico 5&#39;- e 3&#39;- extremidades foram assegurada colocando a sequência de promotor SP6 a montante do primeiro nucleótido adenina do genoma viral e o posicionamento de um local de restrição único artificial Xbal a jusante do último timina nucleótidos do genoma virai, respectivamente. Tampado RNAs sintéticos com o autêntico 5 &#39;e 3&#39; foram produzidos por transcrição de um Xba I-linearizado e tratou-MBN cDNA te run-offmplate utilizando polimerase SP6 ARN preparado com o m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Um análogo de tampão. Este protocolo pode ser modificado de várias maneiras. Para transcrição in vitro, uma outra polimerase de ARN do bacteriófago (por exemplo, T3 ou T7) pode ser utilizado em conjunto com a sua sequência promotora bem definida. 27 Como um local de escoamento, um local de restrição diferente pode ser utilizada se não está presente em do genoma viral e de ARN sintética se a partir do ADNc linearizado termina com o autêntico extremidade 3 &#39;. A importância da sequência de nucleótidos da extremidade 3 &#39;foi demonstrado por uma diminuição ~ 10 vezes na infectividade de ARN, quando uma ARN sintético contém três ou quatro nucleótidos de vírus não relacionados, na sua extremidade 3&#39;. 27 Em uma reacção de transcrição in vitro, tanto o m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A e m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G tampa analógico podem ser utilizados igualmente bem, embora o último lugares um não relacionado nucleótido G adicional a montante do viral 5 &#39;-end, mas issodisso não altera a capacidade de infecção ou replicação de RNA sintético. 27 Além disso, a remoção do molde de ADNc a partir dos transcritos de ARN por digestão com DNase I não é necessário para testes de ARN de infecciosidade, porque o modelo de cDNA em si não é infecciosa. 27 A tecnologia BAC foi agora aplicada à construção de clones de cDNA infecciosos para um punhado de vírus ARN de cadeia positiva, ou seja, dois JEVs, CNU / LP2 27 e SA 14 -14-2 28 (tamanho do genoma, ~ 11 kb); dois vírus da dengue, BR / 90 26 e NGC 29 (~ 11 kb); o vírus da diarréia viral bovina, SD1 (~ 12 kb); 25 dois vírus da peste suína clássica, C e Paderborn (~ 12 kb); 24 o vírus da doença da fronteira, Gifhorn (~ 12 kb); 24 o vírus suíno síndrome reprodutiva e respiratória , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 o vírus da gastroenterite transmissível, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 o felino vírus da peritonite infecciosa,DF-2 (~ 29 kb); 32 a grave coronavírus Síndrome Respiratória Aguda, Urbani (~ 30 kb); 9 do Oriente Médio respiratória síndrome coronavírus, a EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 eo coronavírus humano, OC43 (~ 31 kb) 31 A principal vantagem da utilização de BACs para a construção de cDNA é a elevada estabilidade genética das grandes, 1- ou 2-cópia BAC plasmídeos.; No entanto, a natureza intrínseca da sua número extremamente baixo número de cópias é também uma grande desvantagem, devido a rendimentos muito baixos de DNA de BAC e a consequente redução na pureza do DNA de BAC com respeito à sede de ADN cromossómico. No protocolo atual, o rendimento de DNA BAC é maximizada pela crescente E. coli DH10B transformada com o pBAC BAC infecciosa / SA 14 -14-2 em um meio rico em nutrientes, 2xYT. Apesar deste esforço, o rendimento médio é de apenas ~ 15 ug de DNA BAC a partir de 500 ml de caldo de 2xYT. Além disso, a pureza do DNA de BAC é melhor conseguido através da utilização de CsCl-EtBr centrifugação de gradiente de densidade para a purificação, Em vez do plasmídeo de isolamento à base de coluna utilizada. No entanto, é importante ter em mente que a E. transformado BAC- coli não deve crescer demais porque pode pôr em perigo a estabilidade genética do cDNA clonado, e um crescimento mais elevado não conduz necessariamente a maiores rendimentos ou DNA BAC maior pureza. O protocolo descrito aqui é um, e método aerodinâmico eficiente otimizada para a construção e propagação de um full-length cDNA infeccioso clone geneticamente estável como um BAC para JEV, um procedimento que se pensava praticamente impossível. Esta mesma estratégia de clonagem pode também ser aplicado a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva. Em geral, os clones de ADNc infecciosos permitir-nos introduzir uma variedade de mutações (por exemplo, deleções, inserções e mutações pontuais) num genoma de ARN viral para estudar as suas funções biológicas na replicação virai e patogénese. Este sistema de genética inversa à base de ADNc faz com que seja possível desenvolver e TESt vacina e candidatos terapêuticos que visam um factor de virulência (s) de um vírus de ARN de cadeia positiva de interesse particular. Além disso, esta tecnologia de cDNA infeccioso pode também ser utilizado como um vector virai, capaz de expressar um gene estranho (s) de interesse para muitas aplicações na investigação biomédica.

Para virologistas de ARN, o advento da tecnologia de DNA recombinante no final de 1970, foi possível converter os genomas virais de ARN em clones de ADNc, que pode então ser propagada como plasmídeos em bactérias para a manipulação genética de vírus de ARN. 1 O primeiro vírus de ARN ser molecularmente clonado foi Qp bacteriófago, um vírus de ARN de cadeia positiva que infecta Escherichia coli. Um plasmídeo contendo uma cópia de ADNc completa do ARN genómico Qp deu origem a Qp fagos infecciosos quando introduzido em E. coli. 2 Pouco tempo depois, esta técnica foi aplicada para poliovírus, um vírus de ARN de cadeia positiva de seres humanos e animais. Um plasmídeo que possui um ADNc de comprimento completo do ARN genómico poliovírus foi infecciosas quando transfectadas em células de mamífero e é capaz de produzir viriões infecciosos 3 Nesta abordagem &quot;lançou-ADN&quot;, os ADNc clonados deve ser transcrita intracelularmente para iniciar a replicação do ARN virai.;no entanto, não está claro como a transcrição é iniciada e como as transcrições são transformados com a sequência correcta viral. Esta preocupação tem levado ao desenvolvimento de uma alternativa &quot;lançou-ARN&quot; abordagem, em que uma cópia de cDNA do genoma completo de RNA viral é clonado sob um promotor reconhecido por uma E. coli ou ARN polimerase do fago para a produção de ARN sintéticos in vitro com definido 5 &#39;e 3&#39;, que se submetem a um ciclo completo de replicação virai quando introduzidos em células hospedeiras. 4,5 O primeiro sucesso com esta abordagem foi relatado para brome vírus do mosaico , 6,7 um vírus de ARN de cadeia positiva de plantas. Desde então, a abordagem lançada ARN foi desenvolvido para uma grande variedade de vírus de ARN de cadeia positiva, incluindo calicivírus, alfavírus, flavivírus, coronavírus, e arterivï¿½us. 1,4,5,8 Em ambos o ADN e ARN-lançado sistemas de genética inversa, a construção de um full-clone de ADNc de comprimento é a chave para a geração de ADN ou ARN infecciosos de vus de ARN de cadeia positiva, mas torna-se um considerável desafio técnico, conforme o tamanho do genoma viral aumenta. 9-17 Em particular, um grande genoma de ARN de ~ 10 -32 kb apresenta três principais obstáculos para a clonagem de um ADNc de comprimento completo funcional. 18 A primeira dificuldade é a síntese de um cDNA cópia fiel, uma vez que a fidelidade da RT-PCR é inversamente proporcional ao comprimento do RNA viral. O segundo obstáculo é a presença de sequências potencialmente tóxicos, uma vez que as moléculas de RNA longas são mais prováveis ​​de conter sequências inesperadas capazes de fazer o fragmento de cDNA em plasmídeos instáveis ​​em E. coli. O terceiro e mais importante causa é a disponibilidade de um vector adequado, uma vez que é difícil encontrar um vector de clonagem que pode alojar um inserto de cDNA viral de&gt; 10 kb. Ao longo das últimas três décadas, essas barreiras foram superadas por vários avanços na enzimologia, metodologia, umad vectorology. 1,4,5,8 Destes, o desenvolvimento mais promissor e inovador é a clonagem de grandes vírus de ARN de cadeia positiva cromossomas artificiais bacterianos (BACs como infecciosas). O vector BAC é um plasmídeo de baixo número de cópias de clonagem (1-2 cópias / célula), com base na E. coli factor de fertilidade, com um tamanho médio de inserção de ADN de 19-21 kb ~ 120-350 Um fragmento de DNA é inserida no vector BAC de uma forma semelhante à clonagem em vectores de clonagem gerais.; os clones BAC resultantes são estáveis ​​ao longo de muitas gerações, em E. coli. 22,23 Até à data, a tecnologia BAC foi usado para criar clones de ADNc infecciosos para&gt; 10 membros de três famílias de vírus ARN de cadeia positiva, isto é, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 e Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 Usando vírus da encefalite japonesa (JEV) como um exemplo, o presente trabalho relata os procedimentos detalhados que podem serutilizado para construir um de comprimento completo de BAC infeccioso geneticamente estável para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva. JEV é um flavivírus zoonótica 33 que é transmitida em natureza entre aves, porcos e outros hospedeiros vertebrados por vectores de mosquito. 34,35 Nos seres humanos, a infecção pode causar o JEV grave doença neurológica encefalite japonesa frequentemente fatal (JE), 36 que ocorre na Ásia e partes do Pacífico Ocidental, 37,38 com uma incidência anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. 39,40 O genoma do JEV é uma ~ 11 kb,, molécula de RNA de cadeia simples de sentido positivo e consiste em uma única estrutura de leitura aberta (ORF) flanqueada por duas regiões não codificantes (NCRs) nas extremidades 5 &#39;e 3&#39;. A ORF codifica 41,42 uma poliproteína que é clivada por proteases do hospedeiro e virais para produzir as proteínas individuais 10, designado C, prM, E, NS1, NS2a, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 na direcção N- para C-terminal. 34,43,44 Além disso, uma mensagemXtended forma de NS1 (NS1 &quot;) é expresso por -1 frameshifting ribossomal nos codões 8-9 da NS2a. 45,46 Destes 11 proteínas, as três proteínas estruturais (C, prM e E) são essenciais para a formação de infeccioso viriões, 47,48 e os restantes oito proteínas não estruturais (NS1 a NS5, e NS1 &quot;), são essenciais para a replicação viral de ARN, a montagem de partícula 49-51, 52-56 e 57-59 a imunidade inata evasão. Tanto a 5 &#39;e 3 &#39;NCRs contêm sequências conservadas estruturas primárias e secundárias de ARN forma terciária / 60-62, que são importantes para modular a replicação do ARN virai 63,64. Este protocolo descreve as ferramentas, métodos e estratégias para a geração de um de comprimento completo de BAC infeccioso do JEV SA 14 -14-2. 28 Este clone de BAC funcional contém uma cópia de cDNA completa do ARN genómico JEV, 65, que é abarcado por um promotor para a polimerase de ARN de SP6 a montantedo vírus da extremidade 5 &#39;e um local de restrição Xbal único a jusante da extremidade 3&#39; viral para a transcrição in vitro run-off. Esta tecnologia BAC é aplicável à construção de um clone molecular de cDNA totalmente funcional para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Molecular Cloning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Bottle</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Low Melting Point)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>DE-81 Filter Paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10B&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Toxic and highly mutagenic</td></tr><tr><td>Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Irritating</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Mung Bean Nuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Needle (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Biohazardous (Sharps waste)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom Oligonucleotide Synthesis</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Phenol (Buffer-Saturated)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toxic, corrosive, and irritating</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Sealable Polypropylene Tube (16 &amp;times; 76 mm)&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (yeast)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Cell Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (150 mm)&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette (2-mm Gap)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toxic and carcinogenic</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Six-Well Plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Gel Electrophoresis System</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Desktop Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Para todos os vírus de ARN de cadeia positiva, a fiabilidade e eficiência de um sistema de genética inversa dependerá da estabilidade genética de um ADNc de comprimento completo clonado, cuja sequência é equivalente à sequência de consenso do ARN genómico virai. 27 A Figura 1 mostra uma de cinco passo estratégia para a construção de um cDNA infeccioso de comprimento completo como um BAC para o JEV SA -14-2 14 28: Passo 1, a purificação do RNA virai a partir do sobrenadante de cultura de células de JEV-infectadas células BHK-21 (Figura 1A); Passo 2, a síntese de quatro fragmentos amplificados de ADNc que se sobrepõem (F1 a F4) abrangendo todo o genoma viral (Figura 1B); Passo 3, subclonagem de cada um dos quatro fragmentos de ADNc contíguos num vector BAC, criando pBAC / F1 para pBAC / F4 (Figura 1C); Passo 4, a modificação de ADNc clonados para transcrição in vitro run-off com a ARN-polimerase SP6, isto é, colocando um SP6sequência de promotor imediatamente a montante da extremidade 5 &#39;virais (pBAC / F1 SP6), eliminação de uma pré-existente sítio interno Xba I no nucleótido 9131 através da introdução de uma mutação pontual silenciosa, 9134 Um → T (pBAC / F3 KO), e inserindo um local de run-off novo artificial Xbal imediatamente a jusante da extremidade 3 &#39;viral (pBAC / F4 RO) (Figura 1D); 28 e Passo 5, um conjunto de comprimento completo SA-14 -14-2 ADNc BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Figura 1E). A Tabela 1 lista os oligonucleótidos utilizados neste procedimento de clonagem. Para a construção de um JEV ADNc funcional, o primeiro passo importante é a síntese de quatro fragmentos de ADNc sobrepostos usando o RNA viral purificado como um molde para a RT-PCR. A Figura 2 proporciona um resultado representativo para os quatro produtos de RT-PCR que eram a electroforese em 0,8%em gel de agarose. Este gel demonstra claramente que um de comprimento completo JEV ADNc é amplificado em quatro fragmentos de ADNc que se sobrepõem. Ocasionalmente, as reacções de RT-PCR pode produzir um ou mais produtos adicionais específicos do vírus ou não específicos que são principalmente menor do que o produto esperado, porque o recozimento de inespecífica de iniciadores durante a síntese de cDNA / amplificação. Por outro lado, pouco ou nenhum produto esperado de RT-PCR será amplificado por causa da contaminação com RNase acidental durante o isolamento de ARN viral ou desempenho inadequado do RT-PCR. O próximo passo chave é a clonagem e modificação de um comprimento total de ADNc parcial ou JEV em BAC, que é um procedimento relativamente simples que utiliza técnicas de ADN recombinante convencionais. 69 A Figura 3 apresenta um resultado representativo para a purificação do clone de BAC contendo um cDNA de comprimento total de JEV SA 14 -14-2 por faixas em um gradiente de CsCl-EtBr.Nesta experiência, após a centrifugação durante 16 horas a 401.700 × g, duas bandas distintas, ou seja, a E. coli ADN cromossómico de cima e o ADN super-enrolado plasmídeo BAC abaixo, são visíveis no meio do tubo sob luz ultravioleta de onda longa. Um volume mínimo (~ 400 mL) a banda de DNA de BAC inferior foi cuidadosamente recolhido por abrir um furo com uma seringa, no lado do tubo. Subsequentemente, o EtBr foi extraída a partir do DNA de BAC por extracção com butanol, e o DNA de BAC livre de EtBr foi concentrado por precipitação com etanol. O passo final é a determinação da infecciosidade específica dos ARN transcritos sintéticos in vitro a partir de comprimento completo SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA -14-2 14) após transfecção de ARN em células permissivas (Figura 4). Este passo envolve três passos sequenciais: 1, Passo de linearização de comprimento completo SA 14 -14-2 cDNA no extremo 3 &#39;-end do genoma viral (Figura 4A); Passo 2, a produção de RNAs sintéticos a partir do cDNA linear, através do escoamento de transcrição (Figura 4B); e Passo 3, salvamento dos vírus recombinantes em células BHK-21 transfectadas com os ARN sintéticos (Figura 4C). Experimentalmente, dois clones independentes de pBAC / SA 14 -14-2 foram linearizado com Xbal e tratado com digestão NBM para remover a quatro bases 5 &#39;saliência gerada pela digestão com Xbal. Os BACs linearizados foram limpos por extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol. A linearização dos dois BACs purificados foi demonstrada em um gel de agarose a 0,8% (Figura 5A). A extracção com fenol-clorofórmio deve ser feito com cuidado para assegurar que os BACs linearizados são isentos de RNase. Cada um dos dois BACs linearizados serviu como molde cDNA para a transcrição run-off com a ARN-polimerase SP6 em presença do m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Um análogo cap. A integridade dos RNAs sintéticos foi mostrado através da execução aliquotas das duas misturas de reacção de transcrição em um gel de agarose a 0,6%, juntamente com uma referência de 1 kb escada de ADN (Figura 5B). Neste ensaio simples, a principal banda de ARN proeminente sempre migrado apenas abaixo dos 3 kb referência banda de DNA e parecia estar afiado. No entanto, o RNA degradado teria uma aparência manchada no mesmo gel. Um ensaio centro infecciosa é o padrão ouro para determinar a infecciosidade específica dos RNAs sintéticos. Este ensaio foi realizado por electroporating células BHK-21 com amostras de ARN, semeando alíquotas iguais de 10 vezes de células electroporadas diluídos em série em placas de 6 poços contendo naive células BHK-21 (3 x 10 5 células / poço), e da sobreposição de agarose sobre as monocamadas de células. Após incubação durante 4 dias, as células sobreviventes foram fixadas com formol e coradas com violeta de cristal um solution para quantificar o número de centros infecciosos (placas), que corresponde ao número de moléculas de ARN infecciosos entregues nas células (Figura 6A). Uma vez que o molde de ADNc utilizada para a transcrição in vitro foi demonstrado ser não-infeccioso, 27 de um alíquota da mistura de reacção de transcrição foi utilizado directamente para a electroporação. A electroporação é o método preferido para a transfecção de ARN; Alternativamente, os ARN podem ser transfectadas por outros métodos que utilizam lipossomas de DEAE-dextrano e catiónicos. ARN electroporação é muito eficaz, mas &quot;formação de arco&quot; do impulso eléctrico ocorre raramente se sais estão presentes na reacção de electroporação ou, se o cuvete de electroporação é reutilizado. A expressão de proteínas virais em células transf ectadas com ARN foi analisada por ensaios de imunofluorescência, utilizando um anti-soro de coelho anti-NS1 (Figura 6B). A produção de partículas virais acumulados nos sobrenadantes de células transfectadas com ARN foi umalyzed por ensaios de placas (Figura 6C). Os resultados destas experiências mostram claramente que os RNAs sintéticos derivados de ADNc infeccioso são permissivas em células BHK-21, gerando um título elevado de vírus recombinantes. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sequência A (5 &#39;para 3&#39;) </td><td> Posição b </td><td> Polaridade </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> FormigaiSense </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Sentido </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisense </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td colspan="4"> uma sequência JEV são mostrados em letras maiúsculas, e as sequências BAC são indicados em letras minúsculas. posição b Nucleotide refere-se à sequência completa do genoma de JEV SA 14 -14-2 (número de acesso Genbank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Os oligonucleótidos utilizados para a síntese de ADNc, amplificação por PCR, e mutagénese de BAC. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figura 1.0; Estratégia para a construção de um ADNc de comprimento completo do JEV SA 14 -14-2 como um BAC (A) Isolamento de RNA viral a partir de partículas de JEV.. É mostrado um diagrama esquemático do ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. (B) Síntese de quatro fragmentos de ADNc que se sobrepõem (F1 a F4) que cobre todo o genoma viral. (C) A subclonagem de fragmentos de ADNc que se sobrepõem quatro num vector BAC, criando pBAC / F1 para pBAC / F4. (D) A modificação dos cDNAs clonados para transcrição run-off in vitro. pBAC / F1 SP6 é um derivado de pBAC / F1 que contém a sequência do promotor SP6 a montante da extremidade 5 &#39;virai. pBAC / F3 KO é um derivado de pBAC / F3 que contém uma mutação silenciosa ponto (A 9134 → t, asterisco). pBAC / F4 RO é um derivado de pBAC / F4 que contém um local artificial Xbal de escoamento a jusante da extremidade 3 &#39;virai. (E </<html> strong&gt;) O conjunto inclui um full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figura 2. Síntese de quatro fragmentos de cDNA sobrepostas (F1 a F4) que mede o RNA genómico de tamanho completo de JEV SA 14 -14-2. Os quatro produtos de RT-PCR são avaliados por electroforese em gel de agarose a 0,8%. H, 1 kb escada de DNA. Os tamanhos esperados dos quatro fragmentos de cDNA estão indicados na parte inferior da imagem do gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Purificação de BAC contendo um ADNc de comprimento completo do JEV SA 14 -14-2. O plasmídeo BAC é isolado a partir de E. coli DH10B pelo método de lise alcalina-SDS e ainda purificado por bandagem num gradiente de CsCl-EtBr. Apresentado é um exemplo do gradiente de CsCl-EtBr usando um 16 × 76 milímetros tubo de polipropileno selado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figura 4. Resumo da recuperação de vírus infecciosos a partir de um de comprimento completo JEV SA 14 -14-2 ADNc montado num BAC. (A) A linearização do modelo de cDNA. O full-length JEV BAC é cortado comXbal e tratado com NBM. (B) Síntese dos transcritos de ARN. O ADNc linear é transcrito pela ARN-polimerase SP6 em presença do m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Um análogo de tampão. (C) A recuperação do JEVs sintético. Os RNAs transcritos in vitro são transfectados em células BHK-21 por eletroporação, que gera um elevado título de vírus sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figura 5. Síntese dos ARN por transcrição in vitro utilizando um de comprimento completo JEV BAC como um modelo de cDNA. (A) Produção do corpo inteiro linearizado JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Dois clones independentes de pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 e CL.2) são linearizados por digestão com Xba I e por tratamento subsequente com NBM. Os BACs linearizados são examinados por electroforese em gel de agarose a 0,8%. (B) A produção dos RNAs sintéticos por transcrição run-off. Cada um dos dois BACs linearizado é utilizado como um molde para a RNA-polimerase SP6 de transcrição run-off. Alíquotas das duas reacções de transcrição são corridos num gel de agarose a 0,6%. M, 1 kb DNA ladder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figura 6. infecciosidade específica dos ARN transcritos a partir de um sintéticos JEV BAC de comprimento completo e a recuperação do vírus sintético. Células BHK-21 electroporadas são falsamente (Mock) ou electroporadas com os transcritos de ARN derivados from cada um dos dois clones independentes de todo o comprimento do JEV BAC (Cl.1 e CL.2). (A) a infectividade de ARN. As células são cobertas com agarose e coradas com violeta de cristal a 4 dias após a transfecção. Infectividade de ARN é determinada por ensaios de centros infecciosos para estimar a quantidade de ARN infeccioso electroporada para dentro das células (painel esquerdo). Além disso, imagens representativas de centros infecciosos são mostradas (painel direito). (B) A expressão de proteína. As células são cultivadas em lâminas de câmara de 4 poços. A expressão de proteína virai em células electroporadas ARN a 20 horas após a transfecção (HPT) é analisada por ensaios de imunofluorescência, utilizando um anti-soro de coelho anti-NS1 e um primário de cabra conjugado com Cy3 secundário anti-IgG de coelho (vermelho). Os núcleos são contrastadas com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (azul). As imagens são sobrepostas em imunofluorescência as suas imagens de contraste de interferência diferencial correspondente. (C) o rendimento virai. As células são cultivadas em 150 pratos mm cultura. A produção de viriões infecciosos acumuladas nos sobrenadantes de cultura de células electroporado RNA em 22 e 40 hpt é examinado por ensaios de placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.3K visualizações.  Utah State University. Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

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Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Imunologia e Infecção

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA viruses. By integrating a full RNA genome error-prone PCR and reverse genetics, random genome-wide substitution mutagenesis can be induced. We have developed a method using this technique to synthesize diverse libraries to identify viral mutants with phenotypes of interest. This method, called full-length mutant RNA synthesis (FL-MRS), offers the following advantages: (i) the ability to create a large library via a highly efficient one-step error-prone PCR; (ii) the ability to create groups of libraries with varying levels of genetic diversity by manipulating the fidelity of DNA polymerase; (iii) the creation of a full-length PCR product that can directly serve as a template for mutant RNA synthesis; and (iv) the ability to create RNA that can be delivered into host cells as a non-selected input pool to screen for viral mutants of the desired phenotype. We have found, using a reverse genetics approach, that FL-MRS is a reliable tool to study viral-directed evolution at all stages in the life cycle of the hepatitis C virus, JFH1 isolate. This technique appears to be an invaluable tool to employ directed evolution to understand adaptation, replication, and the role of viral genes in pathogenesis and antiviral resistance in positive-sense RNA viruses.

The protocol describes a method for introducing controllable genetic diversity in the hepatitis C virus genome by combining full-length mutant RNA synthesis using error-prone PCR and reverse genetics. The method provides a model for phenotype selection and can be used for 10 kb long positive-sense RNA virus genomes.

Genética reversa para projetar variantes do vírus de RNA de sentido positivo

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

Genética

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Bioquímica

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modelando o ciclo de vida do vírus Ebola Sob Nível de Biossegurança 2 condições com partículas semelhantes a vírus contendo Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

Resgate do vírus Zika recombinante de um clone de cDNA de cromossomo artificial bacteriano

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

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