The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Todos os ratos utilizados nestes estudos eram ratinhos CD-1 obtidos de Charles River Laboratories. Experiências de cultura anteriores foram também realizados em outras estirpes, tais como C57BL / 6J (dados não mostrados), mas qualquer estirpe pode ser utilizada. Fêmeas adultas grávidas foram aproximadamente 2-3 meses de idade e foram sacrificados por meio de inalação de CO2, seguido por deslocação cervical e toracotomia bilateral antes da remoção do embrião. Os ratos foram alojados em conformidade com as diretrizes do NIH, e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Hospital Medical Center de Cincinnati Children animal Institucional. 1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos <ol><li> Prepara-se uma solução de etanol a 70%. Água deionizada Autoclave (para fazer as câmaras humidificadas e para fabrico de soluções / diluição). Esterilizar instrumentos de dissecação (pinças, tesouras, e 27 g de seringas de agulha) por pulverização para baixo com etanol 70%. </li><li> Preparar10X de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo cálcio e magnésio (80 g NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4, 6,75 ml de 1 M de CaCl2, 3,75 ml de 1 M MgCl2 ). Agita-se a dissolver-se em 1 L de água estéril e autoclavada em seguida o filtro com papel de filtro. Dilui-se 10 vezes com água para fazer 1X PBS. </li><li> Inactivar pelo calor soro fetal de bovino (FBS) a 55 ° C durante 30 minutos e filtra-se esterilizar com um filtro de seringa de 0,22? M. </li><li> Preparar 38 ml de 1X meio de cultura completo (DMEM completo chamado, cDMEM), que consiste de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% de FBS filtrado diluição inactivado pelo calor e 1/100 de estoque de penicilina-estreptomicina. Isso geralmente devem ser usadas frescas, mas pode ser armazenado a 4 ° C durante 1 mês. </li><li> Reconstituir o receptor tirosina Kinase Inhibitor II (TKI II) em DMSO para uma concentração de reserva de 5 mg / ml, e diluir com estoque cDMEM para fazer uma solução de trabalho. O con definitivacentração para este estudo é 1,875 mg / ml em cDMEM. De acordo com as recomendações da empresa, soluções de reserva são estáveis ​​por até 6 meses a -20 ° C. Quanto a soluções de trabalho, fazer fresco e utilizar no mesmo dia. Nota: A concentração da droga na solução de trabalho deve ser duas vezes maior do que a concentração final desejada (uma vez que será diluída duas vezes na gotícula). Ao mesmo tempo, preparar o mesmo volume de cDMEM contendo o mesmo volume de DMSO para o tratamento de &quot;controlo&quot;. </li><li> Prepare os reagentes de digestão da cauda (NaOH 50 mM e 1 M de Tris-HCl [pH 8,0]) separadamente em água destilada. </li><li> Faça um balanço dos iniciadores de PCR XY 25 mM (XY Atacante 5&#39;-TGG TGA AGC TTT CTT TGA G-3 &#39;e XY reversa 5&#39;-CCG CTG TCT CCA AAT TTG G-3&#39;), juntamente com água livre de nuclease. </li><li> Preparar tampão 50X TAE (242 g de Trizma base, 57,1 mL de ácido acético glacial, 100 ml de 0,5 M de EDTA, pH 8,5, e adicionar água a 1 L fio volume final). Preparar tampão de corrida TAE 1X (20 ml 50X TAE diluída com água até 1 L de volume total). </li><li> Para criar uma solução de agarose a 2,5% (0,625 g de agarose, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml de água), solução de agarose calor no microondas até ferver, em seguida, deixe esfriar até cerca de 55-65 ° C (capaz de tocar). Quando esfriar, adicione 2 ml de solução de brometo de etídio a 1%, e despeje gel. CUIDADO! O brometo de etídio é um agente mutagênico e teratogênico; por favor, use luvas de borracha nitrílica e protocolo de segurança adequado ao manusear. Em alternativa, outros agentes de gel de resolução potencialmente menos tóxicos ou corantes podem ser utilizados. </li><li> Preparar solução de bloqueio (PBS com 0,1% de Triton X-100, 10% de soro fetal de bovino [FBS], e 3% de albumina de soro bovino [BSA]) por imunofluorescência. </li><li> Preparar a solução de lavagem (PBS com 0,1% de Triton X-100, 1% de FBS, e BSA a 3%) para imunofluorescência. </li><li> Prepare PbTx (PBS com 0,1% de Triton X-100) por imunofluorescência. </li><li> Prepare as câmaras de incubação para cuLTURE. Preencha grandes pratos (100 mm de diâmetro) de Petri com 35 ml de água autoclavada. Coloque perto de onde dissecção e culturas será realizada. </li></ol> 2. Isolamento de Fetal Testes de Mus musculus <ol><li> Verifique o rato fêmea para plugues vaginais todas as manhãs. Meio-dia no dia em que é detectado o rolhão vaginal é considerado E0.5. Euthanize o mouse fêmea grávida em E11.5, de uma forma consistente com os protocolos de animais aprovados. </li><li> Spray para baixo abdômen rato com etanol 70%. </li><li> Abra a pele da barriga e do peritoneu com uma incisão em forma de V usando tesoura fina e puxe retalho de tecido para trás para expor os órgãos internos. </li><li> Localize os ovários em ambas as extremidades do corno uterino. Com uma tesoura, cortar no ovário e do tecido conjuntivo para separar o útero contendo os embriões a partir do corpo da mãe. </li><li> Abrir a parede uterina cortando cuidadosamente o lado oposto da placenta, expor os sacos de gema. Seja cuidadoso para não puncture saco vitelino de embriões para evitar danificar ou perder. </li><li> Corte perto da placenta para remover os sacos de gema contendo o embrião e colocá-los num prato contendo PBS com cálcio e magnésio. A presença de iões de cálcio e de magnésio ajudará a moléculas de adesão celular de suporte para manter a arquitectura do tecido e evitar que o tecido que adere às ferramentas de dissecação. </li><li> Com uma pinça, remover o saco vitelino e âmnio do embrião por punção cuidadosamente o saco vitelino para criar um orifício no qual o embrião pode deslizar para fora. Uma vez que o embrião está fora do saco vitelino, o corte do cordão umbilical. </li><li> A partir deste ponto em diante, usar um microscópio localizado num capuz de cultura de tecido estéril. Retire a cabeça do embrião e descarte por beliscar com uma pinça de cada lado do pescoço. </li><li> Retire a cauda e coloque em um novo tubo de microcentrífuga para análise XY PCR para determinar o sexo do embrião. Nota: Embora seja óptima para gónadas cultura o mais rapidamente possível após a colheita, é também possível remover ADN da cauda e executar XX / XY genotipagem antes da cultura, de modo que o sexo de cada embrião é conhecido e apenas o sexo desejado precisa de ser cultivadas. Enquanto a genotipagem está a ser feito, os embriões podem ser mantidas separadas (de modo que eles podem ser rastreados) a 4 ° C ou sobre gelo até estar pronta para a cultura. Uma ressalva é que este período fora no útero ou de cultura de condições podem potencialmente afectar a viabilidade para a cultura ou desenvolvimento posterior durante a cultura. </li><li> Prenda o embrião em decúbito dorsal contra a parte inferior da placa de cultura fixando as axilas de embrião com um par de fórceps (geralmente a pinça na mão fraca). Manter esses fórceps no lugar para segurar o embrião ainda durante todo o processo de dissecação. </li><li> Em conjunto com outro par de fórceps, retire a pele cobrindo abdômen e remover suavemente fígado, intestinos e outros órgãos para expor a parede traseira do corpo. </li><li> Como as gónadas será localizada na parede do corpo para trás em ambos os lados da aorta dorsal,um grande vaso sanguíneo que corre ao longo da linha média do corpo, por baixo do cume colher urogenital com uma pinça fechadas e remover o cume urogenital abrindo os fórceps e levantando-se. Como as gônadas serão livremente fixado à parede, tenha cuidado para não puxar para cima muito rápido, sem retirar essas conexões ou as gônadas pode esticar, causando danos aos órgãos. </li><li> Mova o cume urogenital em cDMEM em um prato para se aclimatar tecido a mídia. </li><li> Separa-se o complexo gónadas-mesonephros do resto do rebordo urogenital utilizando agulhas 27 G. Use uma agulha para cortar, pressionando para baixo e usar o outro para orientar o tecido corretamente para permitir a separação ideal. Evite usar um movimento de corte contra o fundo do prato, como agulhas afiadas irá criar pedaços de plástico que pode furar o tecido. Certifique-se de manter os mesonephros completamente ligados à gônada. </li></ol> 3. A cultura de Gonad com um inibidor da pequena molécula <ol><li> Definir dois 20 μl pipetas de 15 ul cada. Cortar cerca de 1-2 mm de uma das pontas de pipeta barreira usando uma lâmina de barbear limpo, esterilizado para a transferência das gônadas e adição de controle cDMEM, enquanto a outra pipeta será usado exclusivamente para cDMEM tratado com o fármaco. </li><li> Alinhar com gónadas seu eixo longo paralelo para a ponta da pipeta de modo que eles podem ser facilmente pipetada utilizando a ponta de corte. Tenha cuidado com gônadas degola para o interior da ponta da pipeta. </li><li> Rotular um lado que a gotícula de controlo e o outro como a gota contendo o fármaco. Apenas duas gotas pode caber em uma tampa prato de 35 mm. Certifique-se de que os rótulos sobre tampas coincidir com os rótulos em microtubos contendo cauda do tecido. </li><li> Pipetar 15 ul de cDMEM contendo um único gónada em uma gota na tampa de uma pequena (35 mm) (prato de cultura de usar somente as tampas, como os fundos são demasiado altos para se ajustar dentro de uma câmara humidificada placa de Petri). Colocar duas gotas contendo gónadas separadas em ambos os lados do prato, FR bem separadosom uma outra. Verificar sob o microscópio para assegurar que as gónadas tenham sido transferidas para as gotículas. </li><li> Para a gotícula designada como controlo, adicionar um adicional de 15 ul de DMSO contendo cDMEM (feito no passo 1.5) para fazer uma gota com um volume total de 30 ul. Utilize apenas a pipeta de &quot;controle&quot; que não vai entrar em contato com a droga. </li><li> Para a outra gotícula (amostra tratada com drogas), adicionar 15 ul de TKI-II contendo cDMEM para fazer uma gota com um volume total de 30 ul. Utilizar apenas a pipeta designada para as amostras tratadas com droga. </li><li> Utilizando a pipeta, espalhar-se as gotículas de um padrão circular em expansão até que eles são cerca de 15-18 mm de diâmetro e da gónada é colocado aproximadamente no meio. Orientar a gônada para que ele fique do seu lado e da gônada e mesonephros são facilmente distinguíveis. Orientar o pulmão, de modo que os dois lóbulos estabelecer plana. <ol><li> Apesar de o diâmetro das gotículas podem variar ligeiramente, garantir que gônadas não são floating e são mantidos no lugar pela tensão superficial. Certifique-se de que as gotas não tocam um no outro, ou o lado da tampa. Sem a tensão superficial, os órgãos vão crescer sobre a tampa durante a cultura e achatar, distorcendo assim a morfologia do órgão. </li></ol></li><li> Cuidadosamente coloque a tampa prato de cultura contendo as gotículas na posição vertical sobre a superfície da água no grande (100 mm) humidificador prato. Assegurar que não existem bolhas de ar por baixo da parte inferior da tampa e que é deitado sobre a superfície da água. Não inverter a tampa e tenha cuidado para não deixar a água tocar o topo da tampa, onde as gotas estão localizados. </li><li> Para criar uma pequena câmara humidificada, cobrir imediatamente com a tampa do prato maior do humidificador para delimitar as culturas gônadas. Agir o mais rápido possível para minimizar qualquer evaporação da mídia. Certifique-se de que o prato menor tem espaço entre ele ea tampa do prato maior para se movimentar livremente; caso contrário, a condensação pode fazer um selo e ba troca de ar de bloqueio para o tecido. </li><li> Uma vez que duas pequenas tampas são colocadas no interior da câmara, colocar imediatamente a câmara para dentro da incubadora. Incubam-se as culturas durante 48 horas de gotículas numa atmosfera humidificada com CO 2 incubadora a 37 ° C. </li></ol> 4. Polymerase Chain Reaction para determinar o sexo de embriões <ol><li> Adicionar as caudas embrionárias a parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar a cada tubo 200 ul de NaOH a 50 mM. </li><li> Coloque a 95 ° C durante 15 minutos ou até que o tecido está completamente dissolvido. </li><li> Adicionar 50 ul de 1M Tris-HCl e vortex levemente e brevemente. </li><li> Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, fazer um novo PCR master mix multiplicando cada volume ao número total de amostras: 0,5 ul de solução de primário de 25 um, com 2,5 uL 10X tampão Taq, 0,5 ul de dNTPs 10 mM (nucleótidos), 19,3 ul de nuclease água livre, 0,2 ul Taq DNA polimerase. Misture bem. </li><li> Adicionar 23ul de PCR Master Mix para PCR tubos contendo 3 ul de lisado de caudas digeridos. </li><li> Flick tubos para misturá-los, em seguida, realizar uma breve centrifugação para trazer as amostras para o fundo do tubo. </li><li> Execute programa XY (Short) PCR (Tabela 1). </li><li> Coloque as amostras com corante (5x) e escada em um gel de agarose a 2,5% em tampão TAE 1X. </li><li> Executar a electroforese em gel de agarose até XX e XY bandas pode ser resolvido. </li><li> Imagem do gel com a imagem de captura de luz UV e. </li><li> Analisar o vs bandas específicas do cromossomo Y X-específica cromossomo (cromossomos X = 331 pares de bases [bp] e XY = 302 bp) 13; XY amostras (male) terá duas bandas de 331 e 302 pb, enquanto XX amostras (feminino) aparecerá como uma única banda 331 pb. </li></ol> 5. Whole Imunofluorescência Mount Organ Dia 1: <ol><li> Retirar as gónadas a partir da cultura, utilizando uma pipeta de 1000 mL com uma ponta de corte. Se desejado, podem sercolocada num prato de PBS para lavar meios e reagentes. Colocar em PBS num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Quanto menor o tamanho do tubo vai economizar reagentes e torná-lo mais fácil de manter o controle de amostras no tubo. <ol><li> Certifique-se de manter o controle e amostras tratadas, bem como amostras XX e XY, em tubos separados e removê-los da cultura com conjuntos separados de pipetas para evitar a contaminação potencial da droga. </li></ol></li><li> Lavam-se as gónadas duas vezes com PBS. Deste ponto em diante, este protocolo pode usar 1X PBS sem cálcio e magnésio. Lavá-los, permitir que as gônadas para desviar para o fundo do tubo (pela gravidade) e, em seguida, remover o líquido acima. Tenha cuidado para não perder gônadas pipetando muito perto deles. </li><li> Remover o máximo possível de PBS do tubo. Adicionar 250 uL de paraformaldeído a 4% em PBS contendo 0,1% de Triton X-100, e deixar incubar O / N a 4 ° C num agitador rotativo. Alternativamente, esta fixação pode ser feita durante 2 horas a 4 ° C num agitador rotativo. CUIDADO! Paraformaldehyde é uma substância tóxica, então siga o protocolo de segurança ao manusear. </li></ol> Dia 2: <ol start="4"><li> Lavar as gônadas duas vezes em 250 ul PbTx em RT. </li><li> Lavam-se as gónadas 3 vezes com 250 ul de PbTx durante 10 minutos cada, à TA num agitador rotativo. </li><li> Bloquear as gônadas, pelo menos, 1 hora em 250 mL solução a RT em uma cadeira de balanço de bloqueio. </li><li> Corar as gónadas o / n a 4 ° C num agitador rotativo em 250 uL de anticorpo primário diluído em Solução de Bloqueio. </li></ol> Dia 3: <ol start="8"><li> Lavar as gônadas duas vezes em 250 mL Solução de Lavagem. </li><li> Lave as gônadas 3 vezes com 250 mL Solução de Lavagem por 10 min cada em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço. </li><li> Bloquear as gônadas 1 hora em 250 mL de bloqueio Solução na RT em uma cadeira de balanço. </li><li> Cobrir o tubo de microcentrífuga com folha de alumínio para proteger os anticorpos secundários fluorescentes da luz. </li><li> Incubar as gônadas 2-4 horas à temperatura ambiente no arocker em 250 uL de anticorpo secundário diluído em Solução de Bloqueio contendo Hoechst 33342. Alternativamente, executar anticorpo secundário e Hoechst 33342 incubação O / N a 4 ° C no balancim. </li><li> Lavar as gônadas duas vezes em 250 ul PbTx. </li><li> Lavam-se as gónadas 3 vezes em 250 ul de PbTx durante 10 minutos cada, à TA num agitador rotativo. </li><li> Usando uma pipeta de ponta de corte, transferir gônadas em um slide com líquido mínimo. Retire o excesso de líquido com pipeta, mas certifique-se que o tecido não seque. </li><li> Orientar as gônadas na forma desejada com uma pinça, e rapidamente adicionar uma gota de meio de montagem para montar as gônadas no slide. Certifique-se os casacos de mídia de montagem todas as amostras completamente; é fundamental para evitar que as amostras sequem. </li><li> Use lamelas (número 1,5 estilo) de tamanho apropriado para cobrir suavemente amostras. Vamos montar propagação mídia entrar em contato com a superfície inteira da lamela. Se necessário, muito pressionar ligeiramente nos cantos de modo que a lamelanão existem grandes bolhas de ar. </li><li> Selar as lâminas com unhas polonês claro em torno das bordas para reduzir a evaporação do meio de montagem. Loja slides montados no escuro a 4 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).</li><li>Maatouk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+beta-catenin+in+XY+gonads+causes+male-to-female+sex-reversal.">Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).</li><li>DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk-sac-derived+macrophages+regulate+fetal+testis+vascularization+and+morphogenesis.">Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).</li><li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ,+the+gonad.">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).</li><li>Walton, K. D., Kolterud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fetal+whole+intestine+culture+system+for+ex+vivo+manipulation+of+signaling+pathways+and+three-dimensional+live+imaging+of+villus+development.">Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development.</a> J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).</li><li>Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+culture+system+to+study+thyroid+development.">An ex vivo culture system to study thyroid development.</a> J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).</li><li>Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+embryonic+mouse+kidney,+culture+in+vitro,+and+imaging+of+the+developing+organ.">Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Combes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Endothelial+cell+migration+directs+testis+cord+formation.">et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation.</a> Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).</li><li>Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+kinase+domain+region+receptor+are+involved+in+both+seminiferous+cord+formation+and+vascular+development+during+testis+morphogenesis+in+the+rat.">Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat.</a> Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).</li><li>Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-mesenchymal+cross-talk+through+Vegf+and+Pdgf+drives+organ+patterning.">Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).</li><li>Clapcote, S. J., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplex+PCR+assay+for+sex+determination+in+mice.">Simplex PCR assay for sex determination in mice.</a> BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).</li><li>Nel-Themaat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Morphometric+Analysis+of+Testis+Cord+Formation+in.">et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in.</a> Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).</li><li>Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+male-specific+role+for+SOX9+in+vertebrate+sex+determination.">A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination.</a> Development. 122, 2813-2822 (1996).</li><li>Morais da Silva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Sox9+expression+during+gonadal+development+implies+a+conserved+role+for+the+gene+in+testis+differentiation+in+mammals+and+birds.">et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds.</a> 14, 62-68 (1996).</li><li>Rockich, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+plays+multiple+roles+in+the+lung+epithelium+during+branching+morphogenesis.">Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).</li><li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+tissue,+two+fates:+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development.">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li><li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad.">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li><li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique.">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este estudo demonstra todo um método de gotícula ex vivo de órgãos que tem muitas aplicações potenciais para o estudo do desenvolvimento fetal. Esta técnica pode ser usada para vários órgãos, e permite ao investigador para abordar questões biológicas que são difíceis de analisar utilizando abordagens in vivo, devido à inacessibilidade dos embriões e potencial letalidade embrionária. Este método de cultura tem benefícios adicionais em relação às outras abordagens in vitro ...

Regeneração de órgãos in vivo em seres humanos é muito limitada; por conseguinte, a engenharia de tecidos, o desenvolvimento dos tecidos e órgãos individuais de células doadas por um hospedeiro, é cada vez mais atraente uma terapia potencial para a substituição de órgãos. No entanto, para esta estratégia terapêutica para ser bem sucedido, os fatores e interações celulares envolvidos na morfogênese do órgão deve ser cuidadosamente estudado e bem-compreendido. Devido à incapacidade para estudar o desenvolvimento de órgãos específicos com abordagens tradicionais, os investigadores voltaram-se para alternativa embrião inteiro ou culturas de órgãos inteiros. Kalaskar et al. 1 têm demonstrado que ex vivo toda a embriogênese cultura produz resultados comparáveis ​​(em 58% dos embriões cultivados) no desenvolvimento do útero, o que sugere que ex vivo métodos de cultura são uma alternativa viável para estudos de organogênese. Um sistema de cultura de órgão individualizado, tal como este ex vivo droPlet sistema de cultura, permite a toda a análise de órgãos independente de efeitos sistémicos, enquanto permite a manipulação de uma via de sinalização específica ou interacções celulares através de adição de reagentes farmacológicos ou anticorpos. Tradicionalmente, o estudo do desenvolvimento dos órgãos do feto tem sido limitada às tecnologias transgénicos e knockout do rato, em adição aos reagentes farmacológicos entregues maternalmente. No entanto, existem problemas técnicos envolvendo essas técnicas e tratamentos in vivo; a maioria das preocupações giram em torno dos efeitos de influenciar vários órgãos simultaneamente, que muitas vezes resulta em letalidade embrionária. Uma preocupação adicional dos estudos manipulando o desenvolvimento do feto é farmacologicamente o efeito materno de drogas no desenvolvimento embrionário no útero (por exemplo, metabolismo materno do fármaco antes de alcançar o embrião) e se tais reagentes podem passar através da barreira da placenta. A técnica de cultura de órgão inteiro descritoaqui foi adaptado a partir de um primeiro protocolo descrito por Maatouk et al. 2, em que gônadas fetais inteiras são incubadas ex vivo em culturas de gotículas na posição vertical. Uma vantagem significativa da cultura gônadas fetais é que os inibidores de pequenas moléculas podem facilmente acessar todo o órgão por difusão simples. . DeFalco et ai demonstraram que utilizando este método ex vivo gota cultura em conjunto com inibidores de moléculas pequenas podem ser usados ​​para estudar processos e das interacções que ocorrem durante o desenvolvimento das gónadas 3 sinalização; estes processos seria difícil de examinar in vivo, devido aos desafios técnicos (por exemplo, a passagem das drogas através da placenta ou letalidade de afectar vários órgãos utilizando abordagens genéticas ou farmacológicos). A cultura gota não é apenas uma melhoria em certos aspectos mais na experimentação útero, mas também é uma melhoria em relação in vitro e ex visistemas VO bem. A utilização de linhas de células para estudar a morfogénese é extremamente difícil porque lhes faltam os tipos de células diferentes, não têm componentes críticos da matriz extracelular (ECM) que permitem a formação de arquitectura de órgãos, e podem exibir artefactos em cascatas de sinalização. Embora a engenharia de tecidos fez melhorias significativas na criação de andaimes simulando ECM, a falta de conhecimento em relação aos quais são os sinais necessários para cada tipo celular durante a organogénese torna difícil construir um sistema do órgão in vitro. Outros sistemas ex vivo foram previamente estabelecido para estudar a organogênese, ou mais especificamente morfogênese, e tem sido muito bem sucedida para geração de imagens ao vivo de órgãos fetais em agar 4, transwells 5, 6 filtros, e outras matrizes de andaime 7,8. A vantagem do sistema de cultura de gotícula é que ele permite o estudo da morfogénese, proporcionando a capacidade de utilizar menos reagentes, que são Often caro, mas dando também a tensão da superfície de órgãos, o que é importante para o crescimento e capacidades de sinalização 9. No rato, a morfogênese testículo inicial ocorre entre embrionário (E) encena E11.5 e E13.5; estas fases compreendem a janela de tempo óptimo para factores que influenciam a diferenciação específicos do sexo examinar. Entre os processos críticos que ocorrem durante a formação dos testículos são a geração de arquitectura cabo de testículo e a formação de uma rede vascular específico do testículo. Utilizando este conjunto de órgãos ex vivo sistema de cultura gota, uma é capaz de alterar a vascularização específicos de macho e testículo inibir a morfogénese, através da utilização de um inibidor de molécula pequena que bloqueia a actividade dos receptores para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); Remodelação vascular mediada por VEGF é crítico para o desenvolvimento dos testículos 10-12. Esta técnica pode ser aplicada com sucesso para outros órgãos e pode ter como alvo tempo específicojanelas de desenvolvimento. Whole-mount imagens de órgãos permite a visualização de estruturas vitais, bem como mudanças estruturais e celulares decorrentes da administração de vários inibidores. Importante, este sistema é vantajosa na medida em que o pesquisador pode ignorar os potenciais efeitos de confusão de administração da droga materna ou perturbação sistémica in vivo durante estratégias gene alvo. Assim, todo esse órgão ex vivo sistema de cultura gota pode melhorar significativamente a capacidade de compreender as interacções e de sinalização que ocorrem especificamente dentro de determinados órgãos durante o desenvolvimento fetal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Strip 0.2 mL PCR Tubes &#38; Detached Flat Caps</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T3218-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1096FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;l SHARP Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe with 27gauge needles</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;M PES syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CO14S-120-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuare</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>R-3200-1XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMZ445 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute 200 proof Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9938&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY PCR Primer&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2482-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Ethidium bromide solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CB-4050-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorMount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Chloride (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>0332-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>Heat-inactivate before using</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>676481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Use at dilution: 1:4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661S</td>
			<td>Use at dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13-1900</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Use at 2ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-165-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31572</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21208</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

Investigando organogênese in utero é um processo tecnicamente desafiador em mamíferos placentários, devido à falta de acesso aos reagentes para embriões que se desenvolvem dentro do útero. Um método de cultura ex vivo gota vertical recentemente desenvolvido fornece uma alternativa atractiva para os estudos realizados in utero. O ex vivo cultura gota fornece a capacidade de examinar e manipular interações celulares e diversas vias de sinalização através da utilização de vários compostos de bloqueio e de activação; Além disso, os efeitos de vários reagentes farmacológicos no desenvolvimento de órgãos específicos podem ser estudados sem efeitos secundários indesejados da administração sistémica de fármacos no útero. Em comparação com outros sistemas in vitro, a cultura gotícula não só permite a capacidade para estudar tridimensional morfogénese e interacções célula-célula, a qual não pode ser reproduzida em linhas de células de mamíferos, mas também requer significativamente menos reagents do que outro ex vivo e in vitro. protocolos Este trabalho demonstra adequada do rato fetal e dissecção do órgão técnicas de cultura verticais gota, seguido por imunofluorescência órgão inteiro para demonstrar a eficácia do método. O método ex vivo gota cultura permite a formação de arquitectura órgão comparável ao que se observa in vivo e pode ser utilizado para estudar processos de outro modo difíceis de estudo devido a letalidade embrionária em modelos in vivo. Como um modelo de sistema de aplicação, um inibidor de molécula pequena vai ser utilizado para sondar a função de vascularização na morfogénese testicular. Este ex vivo gota método de cultura é expansível para outros sistemas de órgãos fetais, como pulmão e potencialmente outros, embora cada órgão deve ser extensivamente estudado para determinar quaisquer modificações específicas do órgão para o protocolo. Este sistema de cultura de órgãos proporciona flexibilidade na experimentação de órgãos fetais, e resulta obtained usando esta técnica vai ajudar os pesquisadores a obter insights sobre o desenvolvimento fetal.

A cultura ex vivo permite que uma gotícula de manipular órgãos inteiros, tais como a gónada, para estudar as interacções celulares e dinâmica. A Figura 1 mostra de uma forma passo a passo como preparar uma cultura E11.5 gonadal gota. Os primeiros passos do protocolo de cultura incluem a remoção inicial do útero contendo embriões de rato a matriz (Figura 1A e 1B). Após a remoção do útero da mãe, a parede uterina é cortado e os embriões são libertados a partir ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis at JoVE.com

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K visualizações.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Vídeo: Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

The primary cilium is fundamentally important in neural progenitor cell proliferation, neuronal differentiation, and adult neuronal function. Here, we describe a method to study ciliogenesis and the trafficking of signaling proteins to cilia in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons using primary neurosphere cultures.

Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Modelo de ferida ex vivo humana e abordagem de coloração de montagem inteira para avaliar com precisão o reparo da pele

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal skeleton. These morphological changes are initiated and sustained through diverse signaling interactions, which often include protein phosphorylation by kinases. Here, two examples of physiologically-relevant contexts in which to study phosphorylation of proteins during mammalian craniofacial development are provided: mouse facial processes, in particular E11.5 maxillary processes, and cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells derived from E13.5 secondary palatal shelves. To overcome the common barrier of dephosphorylation during protein isolation, adaptations and modifications to standard laboratory methods that allow for isolation of phosphoproteins are discussed. Additionally, best practices are provided for proper analysis and quantification of phosphoproteins following western blotting of whole cell protein lysates. These techniques, particularly in combination with pharmacological inhibitors and/or murine genetic models, can be used to gain greater insight into the dynamics and roles of various phosphoproteins active during craniofacial development.

The protocol presents a method for isolating whole cell protein lysates from dissected mouse embryo facial processes or cultured mouse embryonic palatal mesenchyme cells and performing subsequent western blotting to assess phosphorylated protein levels.

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...