Neste artigo, apresentamos um protocolo otimizado de ferida de pele humana ex vivo que pode fornecer dados importantes de eficácia como parte de um pipeline de tradução clínica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma avaliação precisa de alta produtividade do reparo da ferida na pele humana viva. Demonstrando o procedimento estarão Elizabeth Roberts, pesquisadora de pós-doutorado, e Alexandria Kidd, assistente de pesquisa do nosso laboratório.
Para preparar uma amostra de tecido da pele para ferimentos, coloque o lado da dermis da pele para baixo em uma placa de Petri de 90 milímetros e use uma tesoura estéril para remover o tecido adiposo. Quando toda a gordura tiver sido removida, coloque a pele em 25 mililitros de HBSS suplementados com antibióticos por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação intermitente para remover qualquer sangue residual no tecido adiposo. Após 10 minutos, enxágue a pele em 25 mililitros de DPBS.
Após 10 minutos, repita a lavagem do HBSS sem antibióticos e, em seguida, realize uma lavagem final em 25 mililitros de DPBS. Em seguida, coloque uma membrana de filtro de nylon estéril sobre a pilha de almofada absorvente e seque o lado dérmico da pele em gaze estéril em uma placa de Petri de 90 milímetros para remover DPBS residuais. Coloque o lado de derme da pele seca para baixo em uma tampa limpa de placa de Petri de 90 milímetros para remover qualquer DPBS residual e dab a epiderme seca com gaze estéril fresca.
Para criar uma ferida, pressione um soco de biópsia de dois milímetros contra a pele enquanto segura a pele firme e torce suavemente. Usando uma fórceps de tecido dentudos curvos, pegue cada lado da ferida de aproximadamente dois milímetros de diâmetro e enganchar a tesoura Iris curva sob a ferida. Use um soco de biópsia de seis milímetros para fazer uma biópsia ao redor da ferida central de dois milímetros para criar uma explanta de seis milímetros com uma ferida parcial de espessura de dois milímetros no centro.
Em seguida, coloque a exderme epidermis da ferida sobre a pilha de membrana do filtro de nylon para uma incubação de um a sete dias a 32 a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para coloração fluorescente, colete as explantas da ferida em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo 500 microliters de fixação da pele por tubo e incubar as explantas durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, substitua o fixador por um mililitro de tampão de lavagem de manchas.
Após a lavagem, cubra cada amostra com aproximadamente 150 microliters de tampão de bloqueio e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Depois de remover o tampão de bloqueio, adicione 150 microliters de anticorpos primários diluídos no bloqueio de tampão por tubo e incubar as explanações da ferida durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, enxágue as amostras com 500 microliters de tampão de lavagem de manchas contendo 0,2% de azida de sódio seguido por três enxágues em tampão de lavagem regular.
Após a lavagem, adicione 150 microliters de um anticorpo secundário conjugado de floresnce apropriado diluído em tampão de lavagem de manchas a cada poço para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, enxágue a explanta três vezes por 30 minutos em 500 microliters de tampão de lavagem de manchas por lavagem antes de contra-colorindo cada explanta com 150 microliters de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente. Por fim, lave a explanta duas vezes por 30 minutos com 500 microliters de tampão de lavagem por lavagem.
Para imagens explant, coloque uma placa de Petri de 60 milímetros na plataforma de imagem de um microscópio confocal e adicione uma camada de aproximadamente um mililitro de DPBS ao prato. Use fórceps para transferir as explantas da ferida para o prato. Depois de configurar o software de imagem conforme apropriado para o experimento, posicione a ferida no centro do plano de imagem e adquira imagens das biópsias da ferida.
Para realizar imagens de microscópio digital sem fio para obter imagens de alta qualidade de forma econômica, conecte um telefone ou laptop a um microscópio digital sem fio. Coloque as explantas de lado em um pedaço de tecido de laboratório e remova qualquer tampão de lavagem residual da amostra. Em seguida, posicione a explanta no centro do campo de visão do microscópio e adquira imagens usando a câmera conectada.
Imunoperoxidase e imunofluorescência podem ser usados para coloração total do tecido de montagem. Além disso, a coloração viva/morta pode ser realizada em tecido fresco e imagem pré ou pós-fixação. A coloração total das feridas pode ser usada para determinar as taxas de fechamento das feridas de forma reprodutível.
Nesta análise representativa, observou-se fechamento saudável da ferida da pele após quatro a cinco dias, enquanto as feridas de pele diabética não conseguiram fechar totalmente dentro do período de análise de sete dias. A expressão K14 atingiu o pico no segundo dia em feridas de pele saudáveis antes de diminuir rapidamente com o aumento da diferenciação epidérmica. Essa ree epitelialização e a subsequente diferenciação epidérmica foram nas feridas de pele diabéticas.
A reforma da barreira epidérmica precoce exclui a penetração de anticorpos K14 dentro das camadas epidérmicas diferenciadas. No início do processo de reetelialização, os queratinócitos de camada basal positiva K14 migram para dentro sobre a ferida aberta, de tal forma que a epiderme se aproxima da borda da ferida externa se forma mais cedo do que a epiderme mais próxima da borda interna da ferida. Mais tarde, na fase de reparo, a coloração do K14 é perdida à medida que a epiderme se diferencia do exterior para dentro.
A coloração completa do montagem também pode ser usada para estudar a expressão e localização de outros marcadores relevantes da ferida na pele, bem como a presença de células imunes de interesse no local da ferida em diferentes estágios de cicatrização. Gerar feridas excisionais reprodutíveis pode ser um desafio no início. Aconselhamos a prática do procedimento de ferir usando a pele excedente.
