We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).

Este protocolo requer o uso de ao vivo, peixe-zebra adulto para produzir embriões. Os embriões são colhidos para a recolha de tecido. É essencial para obter a aprovação de ética apropriadas conselhos de revisão para realizar esta experiência. 1. Obter Embriões Staged <ol><li> Um dia antes do experimento, preparar saudável, peixe-zebra adulto para reprodução. Coloque um macho e uma fêmea em lados opostos de uma divisória clara em um tanque de criação. </li><li> Repetir para 1,1 como muitos tanques de criação como necessários para a produção de embrião suficiente para a aplicação a jusante. Obter embriões de ambos os tipos de peixe selvagem e peixes transgénicos que expressam proteínas fluorescentes no tipo de célula de interesse. NOTA: O número de embriões necessários para aplicações a jusante nos Passos 2-8 depende da abundância relativa das células de interesse no ponto de tempo de interesse. Embora isso possa variar conforme o tipo de célula, 200 embriões produzir 2.000-5.000 células ordenadas quando o cells de interesse representam &lt;1,0% do total de células em 24 hpf (horas após a fecundação). </li><li> Na manhã seguinte, mudar a água no tanque de cobertura com pão ralado, transferindo peixe para um tanque de criação fresco e eliminar o divisor. Inclinação do tanque a um ângulo para promover o acasalamento. </li><li> Coletar embriões encenadas. <ol><li> A cada 15 minutos, recolher embriões transferindo os adultos a um tanque de criação fresca e passar os ovos que são deixados para trás através de um coador de chá. NOTA: embriões Zebrafish desenvolver de forma síncrona quando mantidas em densidades e temperaturas comparáveis. </li><li> Lavar os ovos com o ovo de água (0,21 g / L sais Instant Ocean em 1 L de água destilada duas vezes) e transferir para um prato de petri. Transferir a placa de Petri para um incubador húmido a 28,5 ° C com circulação de ar. </li></ol></li><li> Duas horas após a última coleção, espécie fertilizados, embriões multicelulares em 10 cm placas de Petri e reduzir a densidade de 50 embriões por prato. Selecionar embriões de uma única, 15janela de tempo min de coleta para aplicação a jusante. Incubar em embriões de 28,5 ° C. NOTA: Por exemplo, recolher embriões às 8:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 e 10:15. Comparando através pontos de tempo, se o maior número de embriões fertilizados são das garras recolhidas às 9:00, em seguida, usar apenas estes embriões para aplicações a jusante. </li></ol> 2. Configurar para a dissociação única célula <ol><li> Cerca de 30 minutos antes do ponto de tempo de interesse (18 hpf) remover embriões a partir de sua córion manualmente com uma pinça fina. </li><li> Recolha e rotular o seguinte para cada condição: dois 2 ml microtubos, um filtro de 40 um celular, um prato de cultura de células de 35 mm, e dois tubos de FACS coberto com um filtro de células 35 ^ m. </li><li> Relaxar os seguintes reagentes no gelo: Ovo de água contendo 0,21 g / L sais Instant Ocean em 1L de água bidestilada; De yolking-tampão E contendo NaCl 55 mM, KCl 1,8 mM, e 1,25 mM de NaHCO 3; e FACS buffer contendo de Leibovitz L-15 meios suplementados com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 5%. </li><li> Traga 1 ml por amostra de celular dissociação Reagente 1 a RT. Thaw 1 ml celular dissociação Reagente 2 por amostra em gelo. Trazer para RT imediatamente antes da utilização. </li></ol> 3. A dissociação celular standard <ol><li> Usando uma pipeta de orifício larga de vidro, 100-300 embriões transferir para um tubo de centrífuga de 2 ml de micro num volume mínimo de água do ovo. </li><li> Eutanásia embriões através da substituição da água com 1 ml de gelo-água fria ovo e submergindo tubo em gelo durante 20 min. CUIDADO! É crítico para obter a aprovação de um comitê institucional adequada supervisão cuidados com animais para este método de eutanásia (refrigeração em gelo seguido de dissociação celular como a eutanásia secundário). eutanásia padrão normalmente requer que os embriões &lt;3 dias pós-fertilização são branqueadas depois de serem arrefecidas, o que não é adequado para a obtenção de células viáveis. </li><li> Lavar os embriões duas vezes com 1 ml de gelo-água fria ovo. Para lavar, use uma ampla pipeta furo de vidro para remover Egg água e uma P1000 para adicionar Egg água. </li><li> Remover a gema, substituindo a água embrião com 1 ml de tampão Deyolking e triturando 8-12 vezes com uma ponta de P1000, ou até que a gema é dissolvido e apenas os corpos dos embriões são visíveis. </li><li> Recolhe-se o tecido por centrifugação a 300 xg durante 1 min. Usar uma pipeta para remover suavemente o sobrenadante sem perturbar o pelete de tecido. Re-suspender em 1 ml de água Egg. </li><li> Repetir o passo 3.5 para um total de três lavagens, mas na lavagem final, re-suspender em 1 mL de RT dissociação celular Reagente 1. </li><li> Incubar em dissociação celular Reagente 1 durante 10 min à temperatura ambiente com os tubos dispostos horizontalmente. Cada 2-3 minutos, tritura-se suavemente com uma pipeta P1000 para evitar aglomeração. NOTA: Punho amostras suavemente durante as etapas de trituração. Em algum momento um único grande grupo, irá formar no tubo a partir de um emaranhado de corpos de embriões. Isso vaidispersar a digestão adicional auxiliado por trituração suave. NÃO VORTEX. </li><li> Recolha de tecido por centrifugação a 300 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de dissociação celular Reagente 2. </li><li> Incubar durante 5-15 min à temperatura ambiente. Colocar os tubos horizontalmente. Cada 2-3 minutos, tritura-se suavemente para evitar aglomeração. Cada 5 min, avaliar o progresso digestão. <ol><li> Para avaliar o progresso de digestão, dilui-se 2 ul de sobrenadante em 18 ul de tampão de FACS e de pipeta, como uma gota sobre uma placa de cultura de células. </li><li> Coloque uma lamela sobre a amostra e observar ao microscópio de cultura de tecidos em 10X e 20X ampliações. NOTA: A preparação deve aparecer como uma mistura de células individuais, pequenos grupos, grandes aglomerados e ocasional corpo embrião na maior parte intacta. </li><li> Visualmente avaliar a proporção da preparação é que as células individuais e pequenos aglomerados. NOTA: Over-digestão irá reduzir a viabilidade; under-digestão reduzirá rendimento de célula única. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Recolha a preparação de células por centrifugação a 300 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e re-suspensão em 1 ml de frio tampão FACS. </li><li> Umedeça um filtro de células 40 mM com tampão FACS. Passar a suspensão de células através do filtro celular de 40 um sobre uma placa de cultura celular de 35 mm. Lavar o filtro de células uma vez com 1 ml de FACS buffer de triagem. </li><li> Transferir o fluxo através de um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Recolher as células por centrifugação a 300 xg durante 5 minutos e re-suspensão em 100 ul de FACS buffer. </li><li> Contagem de rendimento das células utilizando um hemocitómetro. Diluir as amostras de 5x10 6 células por mL, ou concentração óptima recomendadas para máquina de FACS de escolha. Opcional-Ao contar rendimento celular no hemocitômetro, células mortas contracorante com azul trypan para confirmar a viabilidade da preparação de células antes da separação por FACS. NOTA: As preparações que são demasiado diluída terá quantidade excessiva de tempo para resolver. As preparações que são demasiado Concentrated tendem a se agrupar em multímeros e estão abaixo do ideal para classificar uma população pura. </li><li> Reserve 10-20% de cada amostra de usar controles como não coradas. Para as amostras restantes, mancha as células mortas por adição de um / morto (L / D) a discriminação vivo corante fluorescente para cada amostra. Não lavar. NOTA: Qualquer corante fluorescente que penetra nas células com membranas celulares comprometidas e manchas de ácidos nucleicos podem ser utilizados como o corante de L / D, desde que os espectros de fluorescência é compatível com a máquina de FACS de células de escolha e de rotulagem fluoróforo de interesse. <ol><li> Não lavar a preparação após a adição do corante como algumas células morrerão em trânsito para a purificação de FACS e devem ser excluídos da população classificada. </li></ol></li><li> Umedeça o filtro 35 um celular tampado tubo de FACS com 20 ul de tampão FACS. Adicionar células para a peneira e recolher pela gravidade. Armazenar no gelo. </li></ol> 4. FACS Enriquecimento <ol><li> Use FACS para enriquecer única, Células vivas que expressam o marcador fluorescente. <ol><li> Defina uma porta para distinguir as células de detritos em um gráfico de dispersão de dispersão para a frente (FSC-A) amplitude vs amplitude dispersão lateral (SSC-A), ambos com escala linear. Cuidado! Células Zebrafish são geralmente menores do que células humanas mouse ou. Isto reflecte-se uma separação da base inferior entre as células e os detritos. </li><li> Do portão definido em 4.1.1, defina um portão para enriquecer para células individuais e excluir multímeros usando um gráfico de dispersão de altura para a frente de dispersão (FSC-H) e baixa estatura dispersão lateral (SSC-H), ambos com escala linear. NOTA: As células com desproporcionalmente alta FSC-H e baixa SSC-H são prováveis ​​multímeros e são excluídos da classificação. </li><li> A partir do conjunto portão no 4.1.2, usando os controles de cor única, definir um portão para incluir células vivas usando apenas um gráfico de dispersão da FSA-A com escala linear e amplitude do canal usado para detectar L mancha / D com escala log. Incluem células negativas L / D. </li><li> A partir deo portão definido em 4.1.3, usando controles única cor, defina um portão para incluir células vivas apenas com fluorescência positiva usando um gráfico de dispersão da FSA-A com escala linear e amplitude do canal usado para detectar marcador de células proteína fluorescente com escala log . Incluem células positivas. </li><li> Definir os controles de compensação, se necessário, para ter em conta a interferência entre o L mancha / D e espectro de proteína fluorescente. </li></ol></li><li> Set lógica tipo de células que caem em todos os portões definiu no passo 4.1. <ol><li> Usando células duplamente marcadas, verifique gating para separação de células. NOTA: As células de triagem será células, em vez de detritos, células individuais em vez de multímeros, L / células positivos e negativos de fluorescência d. </li></ol></li><li> Ordenação de 2.000-4.000 células da população de interesse em 5 mL de tampão de FACS frio num tubo de microcentrífuga em gelo. Para minimizar corte e pressão sobre as células durante a classificação, use as pressões mais baixas possíveis para a célulaclassificador. NOTA: A gota 5 mL de tampão de FACS serve como uma almofada para células que saem da máquina de FACS. 2.000-4.000 recolha de células directamente em tampão de SCAF elimina a necessidade de centrifugação antes do carregamento para os chips IFC. Esta estratégia é recomendado porque centrifugação pode levar à formação de multímeros se as células aderirem umas às outras no sedimento. </li><li> Avaliar a análise de viabilidade pós-classificação. <ol><li> Transferir 1 ml de células classificadas para um tubo FACS fresco com 100 ul FACS buffer e uma triagem: 1.000 diluição da mancha L / D. Passar as células através do classificador de SCAF com a estratégia de propagação no passo 4.1. Utilizar a proporção de L / D de negativo para positivo para estimar a viabilidade de células separadas. </li></ol></li></ol> 5. As células carga para microfluídica Chip <ol><li> Usando um hemocitómetro, medir a concentração e tamanho de células separadas. <ol><li> Diluir células separadas para, pelo menos, 10 ul. Dilui-se uma alíquota de 5 μ; Células L com 5 ul de azul de tripano. Carregar em hemocitômetro e aplicar lamela. </li><li> Coletar imagens de campo claro de todas as células em 4 x 4 grades de hemocitômetro. Contar o número de células vivas e calcular células vivas / mL. células vivas não ocupam azul de tripano. NOTA: Use qualquer software de análise de imagem padrão para medir o diâmetro de todas as células vivas. Calcule a média eo desvio padrão do tamanho da célula, e selecione uma placa IFC apropriada para a faixa de tamanho de célula de interesse. Se gama de tamanho de célula atravessa uma faixa de tamanho de célula placa IFC, usar várias placas para capturar toda a gama de células de interesse. </li></ol></li><li> células de carga sobre a placa IFC de acordo com as instruções do fabricante (ver Materiais). <ol><li> Dilui-se as células a 1x10 6 culas / mL e realizar a optimização de flutuação de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: otimização flutuabilidade garante que as células não vão para o fundo, nem flutuar para o topo do wel de carregamentol para o carregamento ideal para chips IFC. A proporção de tampão às células pode variar em tipo de célula, mas geralmente varia de 6: 4-7: 3 de células: tampão. </li><li> Adicionar células à placa-IFC ferrado. placa de carga em máquina de fluidos compatíveis, e executar um script de carregamento celular para empurrar as células através do circuito microfluídica e em faixas de captura. </li></ol></li><li> Confirmar que as células são alojados em locais de captura na placa IFC. <ol><li> Retire a placa IFC de máquina de fluidos. Monte a placa IFC em um microscópio equipado com um adaptador de placa. </li><li> Colete instantâneos de campo brilhante e fluorescência para cada local de captura em aumento de 10x. NOTA: Brightfield horas de captura pode variar de 10-50 ms, dependendo da intensidade da lâmpada. horas de captura de fluorescência pode variar de 250-750 ms, dependendo do brilho fluoróforo. Evite células superexposição para evitar photodamage. </li></ol></li></ol> 6. Síntese de ADNc <ol><li> Realizar a lise celular in situ, de acordo com Iinstruções do fabricante placa FC. <ol><li> Adicionar tampões de lise de poços na placa IFC. placa de carga na máquina de fluidos compatíveis e roteiro lise celular prazo, conforme as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Execute transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante da placa IFC. <ol><li> Adicionar reagentes de transcrição reversa para placa IFC. placa de carga na máquina de fluidos compatíveis. Executar script de transcrição reversa. Exemplos de condições de ciclo: 1 ciclo a 25 ° C durante 10 minutos, 1 ciclo a 42 ° C durante 1 h, depois 1 ciclo a 85 ° C durante 5 min. </li></ol></li><li> Realizar pré-amplificação com as sondas específicas de genes de acordo com as instruções do fabricante placa IFC. NOTA: Devido à sua maior especificidade com os números de baixo número de cópias, utilize sondas fluorogênicos marcado ao invés de sondas otimizados para uso com tintas intercalator. <ol><li> primers para a piscina e diluir até final de 180 nM cada. Adicionar primers combinados com placa IFC. placa de carga para fluidi compatívelmáquina de cs. script de pré-amplificação executado. </li></ol></li><li> Realizar pré-amplificação com as seguintes condições de ciclos: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, em seguida 18 ciclos com desnaturação a 95 ° C durante 15 s, em seguida, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 4 min. Loja pré-amplificado de ADNc a 4 ° C até à colheita. cDNA colheita a partir de chapa de microfluidos de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a -20 ° C até o uso. </li></ol> 7. Selecione cDNA a partir de células individuais para único alvo qRT-PCR <ol><li> Dilui-se ADNc em 25 uL de reagente de diluição de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: rendimento final aproximado é de 28 l de cDNA pré-amplificada por célula. Reserva-se uma alíquota de diluente para utilização como um controlo sem modelo no qRT-PCR. <ol><li> Referindo-se ao campo claro e imagens fluorescentes gravadas na etapa 5.3.2, marcar cada local de captura. contar manualmente e registrar o número de células. Avaliar e registrar se cada célula é a gripeorescent. NOTA: Cada site individual pode conter 0, 1, ou&gt; 1 célula, onde&gt; 1 célula inclui locais de captura que contêm várias células e / ou detritos não identificável. Se as imagens são de qualidade suficiente, um valor de pixel podem também ser designado para quantificar a intensidade do sinal de fluorescência. </li></ol></li><li> Seleccione amostras para análise qRT-PCR. <ol><li> Selecione amostras de cDNA a partir de locais de captura identificados na etapa 7.2 que contêm exatamente uma célula com fluorescência positiva. Piscina alíquotas de 1 ul de cDNA de cada amostra. NOTA: Este é o &quot;pool&quot; de controlo positivo utilizado para determinar se os genes de interesse são expressos em qualquer uma das células seleccionadas. </li><li> Escolha de ADNc a partir de pelo menos um local de captura que contém exactamente 0 células como um controlo negativo. Use diluente do passo 7.1.2 como um controle não-modelo. </li></ol></li><li> Executar ensaio de qRT-PCR. <ol><li> Use apenas sondas utilizadas para a pré-amplificação no passo 6.4.1. Carregar todas as amostras em triplicate. As condições de amplificação para uma reacção de 10 ul numa placa de 384 bem: um ciclo de 50 ° C 2 min, um ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos com desnaturação a 95 ° C 15 s, em seguida, emparelhamento e extensão a 60 ° C durante 1 min. </li></ol></li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Validar produtos qRT-PCR por electroforese em gel padrão. produto confirmar é uma única banda no peso molecular esperado (varia para cada sonda). NOTA: Se uma sonda produz múltiplas faixas ou uma única banda com um tamanho impróprio, em seguida, a especificidade é questionável, e isso exclui o gene da análise. </li><li> Examinar todas as curvas de amplificação e são responsáveis ​​por quaisquer anormalidades 14. Calcule o valor médio CT para cada combinação de amostra / gene 15. NOTA: Os valores de CT para controlos positivos normalmente variam de 10-30. valores CT para controlos negativos variam tipicamente 35-40 (sem amplificação). valores CT 30-35 são consideradas muito baixa expressãoe devem ser interpretados com cautela 14. </li><li> Os dados do relatório <ol><li> Se as amostras caem no CT = 10-30, os dados podem ser também relatados como a mudança vezes na transcrição abundância relativa a uma amostra de controlo. NOTA: Fold mudança é igual a 2 ^ (- ΔΔCT) onde ΔCT é relativo a um gene de manutenção por subtracção da média CT da amostra a partir do gene de manutenção e é ΔΔCT as diferenças em ΔCT entre a amostra e um controlo positivo 15. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis%3A+toward+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis: toward the clinic.</a> Genome medicine. 5, (2013).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+genomics%3A+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Single cell genomics: advances and future perspectives.</a> PLoS genetics. 10, e1004126(2014).</li>
<li>Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).</li>
<li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).</li>
<li>Garlanda, C., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells.+Specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).</li>
<li>Diaz-Cano, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity%3A+mechanisms+and+bases+for+a+reliable+application+of+molecular+marker+design%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design.</a> International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cellular+hierarchy+by+single-cell+analysis+of+the+cell+surface+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire.</a> Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Developmental cell. 18, 675-685 (2010).</li>
<li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+lineage+hierarchies+of+the+distal+lung+epithelium+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 509, 371-375 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+early+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Genetics and early development of zebrafish.</a> Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circulation research. 110, 870-874 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+and+microarray+in+transcriptome+profiling+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells.</a> PloS one. 9, e78644(2014).</li>
<li>McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+non-detects+in+qPCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">On non-detects in qPCR data.</a> Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Lyons, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+and+morphogenetic+defects+in+the+heart+tubes+of+murine+embryos+lacking+the+homeo+box+gene+Nkx2-5%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5.</a> Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).</li>
<li>Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+tinman+homolog+demarcates+the+heart+field+and+initiates+myocardial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation.</a> Development. 122, 3809-3816 (1996).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+TGF-beta+binding+protein+3+identifies+a+second+heart+field+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish.</a> Nature. 474, 645-648 (2011).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+field+origin+of+great+vessel+precursors+relies+on+nkx2.5-mediated+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis.</a> Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).</li>
<li>McCurley, A. T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish%3A+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type%2C+developmental+stage+and+chemical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102(2008).</li>
<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li>
<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
<li>Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

O processo aqui descrito utiliza, a expressão de uma proteína fluorescente sob o controlo de um promotor específico do tipo de célula para enriquecer uma população de células progenitoras cardíacas a partir de embriões de peixes-zebra para o uso no sistema de captura de uma única célula assistida de microfluidos para avaliar a expressão de um subconjunto de genes cardíacos em única células. Desde que FACS de excitação e de emissão de laser capacidades são compatíveis com o fluoróforo (s) de escolha,...

A maioria dos estudos atuais de biologia celular e molecular são baseados em médias populacionais. No entanto, os eventos biológicos importantes podem ser mascaradas por estas análises tradicionais de base populacional já que as populações menores podem desempenhar papéis importantes em processos biológicos e evolução da doença. Compreendendo a expressão do gene em populações heterogéneas ao nível da célula individual podem (e têm) levar a insights biológicos e clínicos relevantes 1,2. Motivo de preocupação para estudos de desenvolvimento embrionário, em uma população maior de células, as células progenitoras são muitas vezes sub-representados, tornando-o difícil de detectar mudanças sutis na expressão gênica que em última análise, propor decisões destino celular 3. De modo semelhante, um único tipo de célula pode ter diferentes perfis de expressão, em resposta ao microambiente 4. Por exemplo, células endoteliais residentes no mesmo órgão ou em diferentes órgãos (por exemplo., Aorta ou renal) exibem uma heterogeneidade significativa apesar de compartilhar MORP comumhological e funcionais características 5. Além disso, as células cancerosas que povoam o mesmo tumor também podem ter diferentes perfis moleculares ou mutações ao nível da célula individual 6. Em sistemas modelo, transcriptomics em células individuais identificou com sucesso novas populações de células, caracterizado estados intermediários que ocorrem durante a diferenciação celular, e revelou respostas celulares diferenciais aos estímulos 7,8,9. Tais percepções teriam sido detectáveis ​​em estudos de base populacional convencionais. embriões de peixe-zebra são uma fonte tremendamente subutilizado do caule, progenitor, e as células de diferenciação para explorar questões de heterogeneidade célula única e regulação molecular de identidades celulares durante o desenvolvimento. Sua, ex vivo desenvolvimento e facilidade de manipulação genética altamente estereotipados torná-los um sistema modelo excelente para esta abordagem 10,11. Especificamente, uma grande limitação para a interpretação de uma única célula gendados e expressão é que a identificação fiável de novos estados de células intermediárias durante o desenvolvimento exige um timing muito cuidado de coleta de tecido 9. Isto é necessário para assegurar que a heterogeneidade entre as células capturadas representa heterogeneidade dentro de um tecido a um único ponto de tempo, em vez de heterogeneidade na expressão de genes apresentada pela diferenciação celular dependente da idade. Em comparação com ratos, o desenvolvimento do embrião de peixe-zebra podem ser precisamente sincronizados através de um grande número de embriões 12. Além disso, com os tamanhos grandes de embraiagem, os embriões de peixe-zebra pode ser usado como uma fonte abundante de células estaminais e progenitoras. Este protocolo descreve um método para isolar a partir de embriões de peixe-zebra células e capturar as células individuais utilizando um sistema de chip e Autoprep disponível comercialmente circuito microfluidos integrado (IFC) para análise da expressão do gene qRT-PCR. Este protocolo pode ser rapidamente transferível para quaisquer ensaios de alto rendimento de multiplexagem, incluindo todasequenciamento do transcriptoma que permite a análise mais abrangente da heterogeneidade celular 13. Também oferece várias vantagens para ensaios de expressão de gene tradicionais. O protocolo de isolamento de células individuais produz alta viabilidade depois de FACS, o que diminui a proporção de células comprometidas que são incluídos em aplicações a jusante. Usando um IFC, as células capturadas pode ser observado diretamente para avaliar as taxas de captura e avaliar a saúde das células morfologicamente. Além disso, este protocolo é amplamente aplicável para a comunidade científica peixe-zebra, necessitando apenas de uma linha de peixes transgénicos marcado e acesso às tecnologias de captura de células microfluídicos. Como prova de princípio, células únicas derivadas de progenitores cardíacas foram isoladas e capturado num chip IFC, e, em seguida, a abundância relativa de marcadores de diferenciação cardíaca foi medida por qRT-PCR. Análise da expressão de genes ao nível da célula individual demonstra que células progenitoras cardíacas coexistir com a sua diferenprogênie ntiating. O conhecimento adquirido a partir de perfis de uma única célula de células progenitoras cardíacas podem lançar luz sobre a heterogeneidade nos padrões de expressão gênica entre células progenitoras cardíacas durante o desenvolvimento dos vertebrados, que pode ter sido mascarado nas análises tradicionais de base populacional.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>For removing the chorion from embryos</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 um cell strainer</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes topped with 35 um cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFC chip manufacturer&#039;s protocol</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Version 100-6117 E1 was used in representative experiment</td></tr><tr><td>Wide bore pastuer glass pippette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Adult wild type zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used AB line</td></tr><tr><td>Adult transgenic zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for cell dissociation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double distilled water</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Heat inactivate; any brand of FBS should be fine</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use</td></tr><tr><td>pronase (optional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for IFC plate use and qRT-PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific probes</td><td></td><td></td><td>Probes will vary by experiment</td></tr><tr><td>TaqMan Probe ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Reagents listed in IFC manufacturer&#039;s protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Reagent Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reagents for loading cells onto IFC plate</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CT&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps</td></tr><tr><td>Molecular Biology Quality Water</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC for PreAmp (5-10 um)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>IFC plate for small cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep machine</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>For IFC plate use</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>For counting cells and assessing cell size</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>For removing embryos from chorion</td></tr><tr><td>Tissue culture microscope</td><td></td><td></td><td>For assessing single cell digestion</td></tr><tr><td>FACS machine</td><td></td><td></td><td>For isolating cells of interest</td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of single cells from zebrafish embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Como prova de princípio, a expressão do gene foi avaliada para explorar a dinâmica de diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco. No peixe-zebra, progenitores cardíacos surgir a partir de uma população de células da mesoderme que migram para a mesoderme lateral anterior onde elas se fundem para formar o tubo de coração linear. Antes da fusão, progenitores cardíacos começam a expressar o factor de transcrição Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), que se pensa ser a mais...

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.5K visualizações.  University of North Carolina at Chapel Hill. This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells. 

Vídeo: Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Neurociência

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Genética

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

<meta charset="utf8"></head><body>Preparação de explantes de somita único a partir de embriões de peixe-zebra

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

Preparação de explantes de somita único a partir de embriões de peixe-zebra

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

Processamento de células intestinais de larvas de peixe-zebra para sequenciamento de RNA de célula única

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Autor em destaque: isolando e analisando células intestinais de larvas de peixe-zebra para investigar aspectos transcriptômicos do desenvolvimento gastrointestinal 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

Resumo

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Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Preparação de explantes de somita único a partir de embriões de peixe-zebra

Preparação de explantes de somita único a partir de embriões de peixe-zebra

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única