MG, MO'C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Herv&#233; Cottet (Montpellier) for discussions.

1. Preparação de quitosano Films <ol><li> Pesar 2 g de ácido acético glacial, completa a 100 ml com água ultrapura. </li><li> Pesar 1,7 g de pó de quitosano, juntar 100 ml de solução a 2% m / m de ácido acético aquoso. Agita-se durante 5 dias, com uma barra de agitação e placa de agitação magnética à temperatura ambiente, quer coberto com folha de alumínio ou, no escuro. </li><li> Centrifugar a dispersão de quitosano a 1076 xg a 23 ° C durante 1 h. Recolhe-se o sobrenadante com uma seringa e descartar o precipitado. </li><li> Para cada película, uma alíquota de 10 ml da suspensão de quitosana em plástico de 9 cm de caixa de Petri à temperatura ambiente. Deixar os filmes cobertos para secar por pelo menos 7 dias. </li><li> Usando uma tesoura cortar os filmes secos em 1 x 1 cm quadrados. Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase. </li></ol> 2. Preparação de solução salina tamponada com fosfato (PBS) <ol><li> Pesar 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de hidrogenofosfato dissódico PhosPhate e 0,24 g de di-hidrogenofosfato de potássio. </li><li> Dissolve-se estes produtos químicos pesados ​​em 800 ml de água ultrapura e titula-se a solução com ácido clorídrico concentrado para pH 7,4. Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase. </li></ol> 3. Preparação de tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9,2 <ol><li> Pesar 3,0915 g de ácido bórico. Dissolve-lo em 75 ml de água ultrapura. </li><li> Titula-se a solução de ácido bórico a um pH de 9,2 com uma solução de hidróxido de sódio a uma concentração de 10 M ou superior. Atenção: soluções concentradas de hidróxido de sódio são corrosivos e devem ser manuseados com luvas. </li><li> Completar com água ultrapura para se obter 100 ml de solução. Obteve-se um tampão de borato de sódio 500 mM a pH 9,2. </li><li> Diluir o tampão de borato de sódio 500 mM com água ultrapura com tampão de borato de sódio 75 mM. Nota: O experimento pode ser pausado nesta fase. </li></ol> 4. Preparação de quitosano Films para a reacção de enxerto <ol><li> Lavagem de 10 filmes de quitosana quadrados (1 x 1 cm) em 5 ml de PBS durante 2 h em placas de Petri à temperatura ambiente. </li><li> Durante este tempo, preparar e validar o instrumento de electroforese capilar (passo 5). </li></ol> 5. Preparação e validação do Instrumento de Eletroforese Capilar <ol><li> Prepara-se uma de 43,5 cm nua capilar de sílica fundida, com um diâmetro interno de 50 mm (43,5 centímetros é o comprimento total, o comprimento efectivo para a janela de detecção é normalmente 35 cm), enfraquecendo o revestimento exterior de polímero do capilar com o comprimento conjunto com um utensílio contundente, em seguida, encaixe o capilar. <ol><li> Criar uma janela para o capilar usando um isqueiro para queimar o revestimento de polímero de 8,5 cm da entrada e depois que esfria limpe-o com etanol. Queimar o revestimento do capilar em cada extremidade por alguns milímetros, com um isqueiro, e depois que esfria limpe-o com etanol. </li><li> insi capilar lugarjanela de detecção e instalá-lo na cassete capilar, colocando-o em distâncias iguais na entrada e na saída e enrolando-a em torno dos eixos da cassete. Em seguida, instale a cassete no instrumento eletroforese capilar. </li></ol></li><li> Definir os parâmetros do método para cada separação. No menu do software selecione &quot;método&quot; e depois &quot;editar o método inteiro&quot;. Ajustar a temperatura, o tempo, a tensão, e os frascos utilizados para a separação (por exemplo 25 ° C, 10 min, 30 kV). <ol><li> Na secção de pré-condicionamento, definir os rubores consecutivos: 10 minutos com hidróxido de sódio a 1 M (em água), 5 min com hidróxido de sódio 0,1 M (em água), 5 min com água ultrapura e 5 min com tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9,2 para o primeiro método de uma série de análises. </li><li> Para os métodos subsequentes, definir o conjunto das ondas consecutivas na secção de pré-condicionamento: 1 min com hidróxido de sódio a 1 M (em água), 5 min com tampão de borato de sódio 75 mM a pH 9.2. </li><li> Na secção de injecção, para definir os parâmetros de uma injecção com pressão hidrodinâmico 30 mbar durante 10 segundos para todos os métodos. Na secção de separação, definir as condições de separação a 30 kV, a 25 ° C durante 9 min para todos os métodos. NOTA: Consulte o manual do usuário do instrumento específico CE como procedimento para operar o instrumento CE pode variar entre os fabricantes. Preparar a solução de hidróxido de sódio 1 M no dia. </li></ol></li><li> Injectar e separar um padrão interno de neutro (10 ul de 10% v / v de sulfóxido de dimetilo (DMSO), em água diluída em 450 ul de tampão de borato de sódio 75 mM). Injetar e separar da mesma forma um padrão oligoacrylate (dissolvido em água ultrapura em 10 g ∙ L -1; veja Lista de Materiais) para verificar a validade do capilar. Pausar a sequência aqui até a reacção de enxerto está pronto para começar. </li></ol> 6. Alongamento das RGDS Onto Quitosana Film <ol><li> Pesar o péptido (1 mg RGDS)e os agentes de acoplamento (3 mg de EDC-HCl e 2 mg de NHS). </li><li> 2 horas após o início da imersão filme de quitosano em PBS, dissolve-se o péptido e os agentes de acoplamento em 5 ml de PBS. <ol><li> Tomar uma aliquota de 50 ul desta solução. Adicionar 2 mL de 10% v / v de DMSO em água, como um padrão interno neutro à alíquota. Analisar a alíquota com CE (veja o passo 7). </li></ol></li><li> Remover os 5 ml de PBS utilizada para enxaguar os filmes de quitosana da placa de Petri. Adicionar a solução de 5 ml de agentes de acoplamento de péptidos e para a placa de Petri contendo os filmes de quitosana. </li><li> Cubra o prato de Petri com filme de parafina e colocá-lo em um agitador orbital à temperatura ambiente. Tome 50 mL alíquotas de meios de reacção em tempos do jogo. NOTA: O tempo total de análise de CE é de 15 minutos, assim, uma alíquota pode ser feita a cada 15 minutos (ou a cada 30 min se duas reacções são monitorizadas em paralelo, etc). <ol><li> Adicionar 2 mL de 10% v / v de DMSO em água, como um padrão interno para cada ponto morto aiIQUOT. NOTA: As aliquotas devem ser analisadas com CE, logo que eles são levados (ver passo 7). </li></ol></li><li> Após 4 horas de agitação e remoção de alíquotas, remova a placa de Petri do shaker. Remover o meio de reacção a partir da placa de Petri. Adicionar 5 ml de PBS para lavar os filmes de quitosana. </li><li> Remover o PBS a partir da placa de Petri, lavar o filme quitosana com água ultrapura e permitir-lhes a secar durante a noite. Remover a água ultrapura e armazenar as películas à temperatura de -20 ° C em uma placa de Petri de plástico. </li></ol> 7. Monitoramento de Reação Enxerto Usando CE <ol><li> Injectar e alíquotas separadas de meio de reacção imediatamente após a remoção da placa de Petri utilizando as condições de análise como na secção 5.2. </li><li> Após a conclusão das separações enxaguar o capilar com água ultrapura durante 10 min. Seque-o através de um flush com um frasco vazio (ar) durante 10 min. NOTA: O experimento pode ser pausado nesta fase. </li></ol> 8. Dados Trea<html> tamento para CE <ol><li> Verificar a validade de cada separação, por verificar que tanto a corrente durante a separação e o tempo de migração do marcador mobilidade electro-osmótico (DMSO neste caso) são semelhantes aos observados para a separação padrão oligoacrylate. NOTA: até 10-15% de variação é aceitável do valor atual esperado de cerca de 50 mA e valor tempo de migração de 1,3 min (valores de mobilidade eletroforética deve ser usado em vez de tempos de migração se um repetibilidade superior é exigido). </li><li> Para cada separação bem-sucedida, exportar os dados brutos do software eletroforese capilar, selecionando um conjunto de dados específico, clique direito sobre a exportação e selecionar um sinal apropriado. </li><li> Converter os dados em bruto gravados pela CE (apresentada como absorvância de UV em função do tempo de migração). Converter o eixo X (tempo de migração T m) para uma mobilidade electroforética μ seguinte equação 1: n 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg &quot;/&gt; (1) em que L é o comprimento d ao detector, G t é o comprimento total do tubo capilar, V é a tensão, e t EO é o tempo de migração de uma espécie neutra (padrão interno DMSO neste caso) 27. Converter o eixo Y dos dados em bruto (absorvância em AU) para uma distribuição de mobilidades electrof W (μ) seguinte equação 2: 28 <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54549/54549eq2.jpg" /> (2) </li></ol> 9. Caracterização Adicional dos enxertado com Peptídeo 18 Films <ol><li> Insira filmes de quitosana enxertado com peptídicos, laminados em torno de si, em um solid-state rotor NMR 4 mm. Encher o rotor com solução salina tamponada com fosfato a inchar dos filmes, e fechar o rotor. Espere por algumas horas. </li><li> Analisar o filme com 13 &lt;/ sup&gt; C espectroscopia de RMN 18. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A simplicidade do protocolo descrito aqui torna-o idealmente adequado para aplicação generalizada. No entanto, uma atenção especial deve ser dada a uma das seguintes etapas principais. Preparação instrumento adequado CE É importante para separar um padrão conhecido, imediatamente antes da separação de amostras desconhecidas (bem como no fim de uma série de separações) para verificar a validade do capilar e instrumento no dia. Este pa...

Electroforese capilar solução livre (CE) é uma técnica que separa os compostos em soluções com base na sua razão de carga de 1,2-para-fricção. Relação carga-to-size é frequentemente mencionado na literatura, mas essa simplificação não se aplica a polielectrï¿½itos, incluindo polipeptídeos neste trabalho, e também foi mostrado para não ser apropriado para pequenas moléculas orgânicas 3. CE difere de outras técnicas de separação em que o mesmo não possui uma fase estacionária, apenas uma electrólito fundo (geralmente um tampão). Isso permite que a técnica para ser robusto em sua capacidade de analisar uma grande variedade de amostras com matrizes complexas 4, tais como fibras de plantas 5, cervejas de fermentação 6 de enxertia em polímeros sintéticos 7, amostras de alimentos 8, e peptídeos dificilmente solúveis 9 sem preparação da amostra tedioso e purificação. Isto é especialmente significativo para polielectrólitos complexos que têm problemas de dissolução (suito como quitosano 10 e goma de gelano 11) e, por conseguinte, existir como agregados ou precipitado na solução e foram analisados com sucesso sem a filtração da amostra. Além disso, a análise de açúcares em cereais de pequeno almoço envolveu injetar amostras com partículas de amostras de cereais de pequeno-almoço precipitado em água 8. Isto também se estende para a análise de polielectrólitos ou copolímeros ramificados 12,13. Extenso trabalho também foi concluído no desenvolvimento de técnicas de CE especificamente para a análise de proteínas para proteómica 14, separação quiral de péptidos naturais ou sintéticos 15 e separações microchip de proteínas e péptidos 16. Uma vez que a separação e a análise ter lugar em um capilar, apenas pequenos volumes de amostra e são usados solventes que permite CE ter um custo de exploração mais baixa do que outras técnicas de separação, incluindo 5,6,17 cromatografia. Uma vez que a separação por CE é rápido, que permite que o monitoanel de cinética da reacção. Isto foi demonstrado no caso do processo de enxerto de péptidos sobre os filmes de quitosano para uma melhor adesão da célula 18. O quitosano é um polissacárido derivado do -deacetylation N de quitina. Filmes de quitosano pode ser usado para várias aplicações biomédicas, tais como bio-adesivos 19 e substratos de crescimento de células 18,20, devido à biocompatibilidade do quitosano 21. Ligação de células a proteínas de matriz extracelular específicos, tais como fibronectina, laminina e colagénio, está directamente relacionada com a sobrevivência das células 22. Notavelmente, tipos de células diferentes, muitas vezes exigem apego a diferentes proteínas da matriz extracelular para a sobrevivência e funcionamento correto. A fixação de células de filmes de quitosana foi mostrado para ser melhorada através da enxertia de fibronectina 23; No entanto, a preparação, purificação e enxertia de tais proteínas grandes não é economicamente viável. Em alternativa uma variedade de pequenos péptidos Have foi mostrado ser capaz de imitar as propriedades de grandes proteínas da matriz extracelular. Por exemplo, péptidos, tais como os miméticos de fibronectina RGD (arginina - glicina - ácido aspártico) e RGDS (arginina - glicina - ácido aspártico - serina) têm sido usadas para facilitar e aumentar a ligação de células 24. Covalente enxerto de RGDS sobre os filmes de quitosana resultou na fixação das células melhorado para células conhecidas para anexar a fibronectina in vivo 18. Substituindo proteínas maiores gosta fibronectina com péptidos mais pequenos que têm a mesma funcionalidade proporciona uma significativa redução de custos. Aqui, o péptido de enxertia para a quitosana foi realizada como publicado anteriormente 18. Como demonstrado previamente, esta abordagem fornece enxerto simples e eficiente, utilizando os agentes de acoplamento de EDC-HCl (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) e NHS (N-hidroxissuccinimida) para funcionalizar o ácido carboxílico da RGDS ser enxertado nafilme de quitosana. Duas vantagens deste método são que o enxerto não exige qualquer modificação do quitosano ou do péptido, e é realizada em meio aquoso, para maximizar a compatibilidade com as aplicações de cultura de células futuras 18,20. Como os agentes de acoplamento e o péptido pode ser cobrado, CE é um método adequado para a análise da cinética de reacção. Mais importante, a análise da cinética da reacção por meio de CE permite a monitorização em tempo real da reacção de enxerto, e, portanto, permite a optimização tanto e quantificar o grau de enxertamento. Embora não seja necessário rotineiramente, os resultados da análise de CE pode ser validado off-line por uma medição directa do péptido enxertando sobre os filmes de quitosano usando espectroscopia de 25,26-RMN de estado sólido (ressonância magnética nuclear) para demonstrar o enxerto covalente do péptido sobre a película 18. No entanto, em comparação com a do estado sólido espectroscopia de RMN, a análise em tempo real fornecida pelaCE permite a quantificação do consumo de péptido em tempo real e, assim, a capacidade de avaliar a cinética da reacção. O método acima mencionado é simples e permite a análise em tempo real de péptido enxertia em filmes de quitosana com quantificação indirecta da extensão da enxertia. O método demonstrado pode ser estendido para a avaliação quantitativa em tempo real de diferentes reacções químicas, desde que os reagentes ou os produtos a serem analisados ​​pode ser carregada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Water</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chitosan powder (medium molecular weight)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>448877</td>
			<td style="width:479px;">lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">2-2.5L GL</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4540</td>
			<td>laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465&#160;</td>
			<td>laboratory reagent, corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RGDS&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:119px;">H&#8208;1155</td>
			<td>peptide, bought from Auspep Pty Ltd</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D80002</td>
			<td>Irritant to skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">130672</td>
			<td>Irritant to skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>466-500G</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>384-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium hydrogen phosphate - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>1234-500G</td>
			<td>laboratory reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>4745-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Oligoacrylate standard</td>
			<td style="width:185px;">custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BDH AnalR, Merck Pty Ltd</td>
			<td style="width:119px;">10058</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">A1367-2.5L</td>
			<td>laboratory reagent, corrosivie</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fused silica tubing</td>
			<td style="width:185px;">Polymicro (Molex)</td>
			<td style="width:119px;">TSP050375</td>
			<td style="width:479px;">Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 &#181;m internal diameter, 363 &#181;m outer diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 7100 CE</td>
			<td style="width:185px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G7100CE</td>
			<td>Capillary electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">KS260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Electronic balance</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;">MS204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Milli-Q Synthesis&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZMQS5VF01</td>
			<td>Ultrapure water filtration system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Parafilm&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Labtek</td>
			<td style="width:119px;">PM966</td>
			<td>Parrafin wax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis to monitor peptide grafting onto chitosan films in real time

electroforese capilar de solução livre (CE) separa os analitos, compostos geralmente praticados na solução por meio da aplicação de um campo eléctrico. Em comparação com outras técnicas de separação analíticas, tais como cromatografia, CE é barato, robusto e eficaz não requer a preparação da amostra (por um certo número de matrizes naturais complexas ou amostras poliméricas). CE é rápido e pode ser utilizado para seguir a evolução de misturas em tempo real (por exemplo, cinética de reacção química), tal como os sinais observados para os compostos são separados são directamente proporcional à sua quantidade em solução. Aqui, a eficiência da CE é demonstrada para a monitorização do enxerto covalente de péptidos sobre os filmes de quitosana para aplicações biomédicas subsequentes. propriedades antimicrobianas e biocompatíveis da quitosana torná-lo um material atraente para aplicações biomédicas, tais como substratos de crescimento celular. Enxerto covalentemente os RGDS péptido (arginina - glicina -ácido aspártico - serina) sobre a superfície de filmes de quitosano tem por objectivo melhorar a fixação celular. Historicamente, a cromatografia e a análise de aminoácidos têm sido utilizados para fornecer uma medida directa da quantidade de péptido enxertado. No entanto, a separação rápida e ausência de preparação de amostras fornecidas pela CE permite o monitoramento em tempo real igualmente precisa ainda do processo de enxertia peptídeo. CE é capaz de separar e quantificar os diferentes componentes da mistura reaccional: o (não enxertados) péptido e os agentes de acoplamento químico. Deste modo, o uso de CE resulta em filmes melhoradas para aplicações a jusante. Os filmes de quitosana foram caracterizados por meio de estado sólido RMN (ressonância magnética nuclear) espectroscopia. Esta técnica é mais demorada e não pode ser aplicada em tempo real, mas produz uma medição directa do péptido e, assim, valida a técnica CE.

CE está bem adaptado para monitorar a enxertia de péptidos (por exemplo, RGDS) sobre os filmes de quitosano. Os agentes de acoplamento adequados incluem EDC-HCl e NHS que activam o péptido a ser enxertado na quitosano (Figura 1). CE é capaz de separar os diferentes moléculas de interesse a partir do meio de reacção. Para designar os picos no electroferograma, RGDS puros, EDC-HCl e NHS foram dissolvidos, injectados separadamente e separada. Após a atribui...

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Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.0K visualizações.  Western Sydney University. Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

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A Technique to Functionalize and Self-assemble Macroscopic Nanoparticle-ligand Monolayer Films onto Template-free Substrates

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and scalable technique efficiently functionalizes metallic nanoparticles with thiol-ligands in a miscible water/organic solvent mixture allowing for rapid grafting of thiol groups onto the gold nanoparticle surface. The hydrophobic ligands on the nanoparticles then quickly phase separate the nanoparticles from the aqueous based suspension and confine them to the air-fluid interface. This drives the ligand-capped nanoparticles to form monolayer domains at the air-fluid interface.&#160; The use of water-miscible organic solvents is important as it enables the transport of the nanoparticles from the interface onto template-free substrates.&#160; The flow is mediated by a surface tension gradient3,4 and creates macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle-ligand films.&#160; This self-assembly technique may be generalized to include the use of particles of different compositions, size, and shape and may lead to an efficient assembly method to produce low-cost, macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle films for wide-spread applications.

A simple, robust and scalable technique to functionalize and self-assemble macroscopic nanoparticle-ligand monolayer films onto template-free substrates is described in this protocol.

Uma técnica para funcionalizar e auto-montar macroscópicas Nanopartículas-ligante monocamada Films em substratos sem Modelo

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and ...

Química

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

Arrefecimento Medidas de freqüência Elipsometria Dependentes para determinar a dinâmica de finas Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rápida de alta capacidade: Identificação de Espécies de material botânico Usando Direct Análise em Tempo Real alta resolução Espectrometria de Massa

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando Eletroforese Capilar para quantificar ácidos orgânicos a partir de tecido da planta: um caso de teste de exame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Sementes

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Grafting Multiwalled Carbon Nanotubes with Polystyrene to Enable Self-Assembly and Anisotropic Patchiness

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a free-radical polymerization strategy to enable the modulation of the nanotube surface properties and produce supramolecular self-assembly of the nanostructures. First, a selective hydroxylation of the pristine nanotubes through a biphasic catalytically mediated oxidation reaction creates superficially distributed reactive sites at the sidewalls. The latter reactive sites are subsequently modified with methacrylic moieties using a silylated methacrylic precursor to create polymerizable sites. Those polymerizable groups can address further polymerization of styrene to produce a hybrid nanomaterial containing PS chains grafted to the nanotube sidewalls. The polymer-graft content, amount of silylated methacrylic moieties introduced and hydroxylation modification of the nanotubes are identified and quantified by Thermogravimetric Analysis (TGA). The presence of reactive functional groups hydroxyl and silylated methacrylate are confirmed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Polystyrene-grafted carbon nanotube solutions in tetrahydrofuran (THF) provide wall-to-wall collinearly self-assembled nanotubes when cast samples are analyzed by transmission electron microscopy (TEM). Those self-assemblies are not obtained when suitable blanks are similarly cast from analogous solutions containing non-grafted counterparts. Therefore, this method enables the modification of the nanotube anisotropic patchiness at the sidewalls which results into spontaneous auto-organization at the nanoscale.

A procedure for the synthesis of polystyrene-grafted multiwalled carbon nanotubes using successive chemical modification steps to selectively introduce the polymer chains to the sidewalls and their self-assembly via anisotropic patchiness is presented.

Enxertia de nanotubos de carbono de Multiwalled com poliestireno para habilitar auto-montagem e anisotrópica Patchiness

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análise de respiração em tempo real usando o Nanoelectrospray secundário ionização acoplada a espectrometria de massa de alta resolução

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real

Resumo

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