Name: utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).

1. Preparação de placas de 96 poços de siRNA NOTA: As bordas exteriores de uma placa de 96 poços são mais propensas a evaporação em comparação com outros poços, portanto, limitar a quantidade de siRNAs de 60 por placa de 96 poços. Preencha poços exteriores com meio simples ou PBS para limitar isso. Além disso, um ecrã de visitas de validação é recomendado para aliviar polarizações placa. <ol><li> Diluir os siRNAs de 250-500 ng / mL em meio de soro reduzido (conforme as recomendações do fabricante) e uma alíquota de 10 ul às cavidades apropriados da placa de fixação ultra-baixa. Executar todas as telas em triplicado. NOTA: Incorporar controles siRNA não-alvo (negativo) e matando (positivo, como UBB e PLK1) apropriadas no design da placa para garantir a eficiência de transfecção pode ser avaliado. A utilização de chapas de fixação para baixo o trabalho siARN é crítico, como células vão ser adicionados à mistura de transfecção. Não podemos descartar que alguns fabricantes de ultra-baixo apegoplacas podem ter efeitos sutis sobre crescimento de esferóides. Como tal, recomenda-se que estes são testados pelo utilizador final. </li><li> Cubra as placas com selos adesivos e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. A transfecção reverso da Linha celular <ol><li> No dia da tela, descongelar as placas à temperatura ambiente e girar durante 5 minutos a 1000 x g utilizando uma centrífuga de bancada. Adicionar 10 ul de meio de soro reduzido contendo o reagente de transfecção optimizada para cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Deixar as placas durante 15 min para os complexos de transfecção contendo siARN para formar. NOTA: Este estudo utilizou a linha celular do cancro da mama BT474 para o rastreio genómico funcional (cultivadas em DMEM de glicose elevada (por Dulbecco Modified Eagle Médium) suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos). </li><li> Tripsinizar as células a serem rastreadas (tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM) até que se destacam a partir do balão, neutralizar usando volume apropriado de linha celular especiIC médio e centrifugação durante 5 min a 1000 xg numa centrífuga de bancada para remover a tripsina. Ressuspender as células com um volume apropriado de meio e determinar o número de células precisa utilizando um contador de células. NOTA: Normalmente 5.000 células por poço são suficientes para a formação esferóide na maioria das linhas celulares testadas. É importante contar com precisão as células como uma suspensão de células individuais para comparações de tamanho precisos. </li><li> Dilui-se as células a 5000 células por 180 uL de meio frio (4 ° C). NOTA: A adição de componentes de matriz de membrana basal reconstituída irá impactar negativamente a eficiência de transfecção e recomenda-se que ele não é usado. linha de otimização de celular para confirmar a formação esferóide capacidade e eficácia knockdown deve ser realizada antes da tela. </li><li> Transferir a suspensão de células a um reservatório, pipeta para misturar e adicionar 180 uL de cada poço da placa de fixação 96 poços ultra-baixo, contendo o siRNA preparado anteriormente (2,1). </li><li> Centrifuge a placa a 1000 x g numa solução pré-arrefecida de 4 ° C, centrifuga-se durante 10 min e, em seguida, voltar para uma incubadora de cultura de tecido de 37 ° C. </li><li> NOTA: As células aparece como um mosaico no fundo dos poços. Durante o próximo 12-24 horas, as células irão agregar em conjunto para formar uma única esfera. </li><li> Após 24 h, as células observar formar um único esferóide no centro do poço. Adicionar 100 uL de meio completo a cada poço para encorajar o crescimento. </li><li> Reabastecer meio depois de três dias. Remova cuidadosamente 100 ul de meio de cada poço e adiciona-se 100 uL de meio fresco. </li><li> No dia 7, quantificar o tamanho esferóide automatizado em um leitor de placas que pode monitorar quantitativamente crescimento de esferóides ao longo do tempo (ver Secção 3). </li><li> Em seguida, determinar a viabilidade celular utilizando um corante de viabilidade celular luminescente (ver Secção 4). </li></ol> 3. Automated Image Acquisition <ol><li> Digitalizar as placas em uma bancada, imagiologia placa micro-bem citômetro no dia 7. <ol> &lt;li&gt; Abra o software, selecione o seguinte: &#39;96 -bem placa &#39;, selecione o tipo de placa apropriado e insira um nome de experimento. NOTA: Todas as informações adicionais também podem ser adicionadas para o software. </li><li> Selecione o aplicativo &#39;Tumorsphere&#39;. Alterar o foco para que o esferóide está em foco e tem um contraste perfeito. NOTA: Recomendamos &#39;foco baseado em imagem&#39; como variações significativas nos tamanhos esferóides são esperados. </li><li> Selecione os poços que necessitam de digitalização e &quot;Iniciar verificação&quot;. </li><li> Usando o software do scanner placa, certifique-se de que a máscara objeto representa com precisão o tamanho esferóide. Para fazer isso, ajustar as configurações de diâmetro colônia, dilatação das fronteiras, de espessura mínima e precisão, específico para cada linha de células testadas 11,12. Nota: A área esferóide será então calculada usando o algoritmo de software. Por exemplo, para calcular com precisão a área de esferóides BT474 cultivados por sete dias ajuste de precisão para &#39;alta&#39; umd definir o diâmetro mínimo colônia para 200? M. Isso deve produzir um representante máscara esferóide adequada da área esferóide. NOTA: Estes dados podem ser exportados a partir da máquina, usando a função de exportação, no sob a forma de um arquivo de dados anotada. Data é placa média normalizada, combinadas e analisadas tanto por z-score ou diferença média rigorosamente padronizado (SSMD) para identificar siRNAs que tiveram um efeito estatisticamente significativo na área de esferóide. </li></ol></li></ol> 4. Determinar a viabilidade celular <ol><li> Após a área de esferóide foi calculada, determinar a viabilidade celular utilizando um corante de viabilidade luminescente. Prepara-se o reagente de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> remover cuidadosamente 100 ul de meio de cada poço e adiciona-se 100 ul de corante de viabilidade. Incubar as placas durante 15 min, em seguida, digitalizar utilizando um leitor de placas luminescente. NOTA: Estes dados podem ser exportados a partir da máquina, usando a função de exportação, em noa forma de um ficheiro de dados anotados. Data é placa média normalizada, combinadas e analisadas tanto por z-score ou diferença média rigorosamente padronizado (SSMD) para identificar siRNAs que tiveram um efeito estatisticamente significativo sobre a viabilidade esferóide. </li></ol>

<ol>
	<li>Seton-Rogers, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+the+ErbB2+receptor+and+transforming+growth+factor+beta+in+induction+of+migration+and+invasion+in+mammary+epithelial+cells.">Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Chia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+a+novel+hypoxia-regulated+marker,+carbonic+anhydrase+IX,+in+invasive+breast+carcinoma.">Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma.</a> J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).</li><li>Trastour, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+and+CA+IX+staining+in+invasive+breast+carcinomas:+prognosis+and+treatment+outcome.">HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome.</a> Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).</li><li>Ros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metabolic+screen+identifies+6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase+4+as+an+important+regulator+of+prostate+cancer+cell+survival.">Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival.</a> Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).</li><li>Baenke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+identifies+MCT4+as+a+key+regulator+of+breast+cancer+cell+metabolism+and+survival.">Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival.</a> J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).</li><li>Schug, Z. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+synthetase+2+promotes+acetate+utilization+and+maintains+cancer+cell+growth+under+metabolic+stress.">Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress.</a> Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+is+a+bioenergetic+substrate+for+human+glioblastoma+and+brain+metastases.">Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases.</a> Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).</li><li>Comerford, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+dependence+of+tumors.">Acetate dependence of tumors.</a> Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> J Vis Exp. (99), e52686 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Maguire, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SF3B1+mutations+constitute+a+novel+therapeutic+target+in+breast+cancer.">SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer.</a> J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).</li><li>Brough, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+viability+profiles+of+breast+cancer.">Functional viability profiles of breast cancer.</a> Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).</li><li>Ferber, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3a+regulates+reactive+oxygen+metabolism+by+inhibiting+mitochondrial+gene+expression.">FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression.</a> Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).</li><li>Jensen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO3A+promotes+metabolic+adaptation+to+hypoxia+by+antagonizing+Myc+function.">FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function.</a> EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cell-mediated+adhesions+in+breast+cancer+spheroids.">Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids.</a> Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).</li><li>Bitler, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+by+targeting+EZH2+methyltransferase+activity+in+ARID1A-mutated+cancers.">Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers.</a> Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).</li></ol>

Open Access fees were supported by Nexcelom Bioscience, LLC.

Modelos tridimensionais de cancro estão a ser cada vez mais utilizadas para avaliar a eficácia de compostos conhecidos e novos, que foram concebidos para matar selectivamente as células cancerosas. Esferóides de células cancerosas são estruturas que apresentam condições mais semelhantes às encontradas em tumores in vivo, assim, compostos que aumentaram a eficácia em 3D são mais propensos a ter um efeito in vivo. No entanto, essas modalidades não permitem a identificação de novos alvos potencialmente que não tenham sido objecto de desenho de drogas que poderia ter considerável eficácia no tratamento do cancro. Desenvolvemos um siRNA abordagem genómica funcional que permitiu o silenciamento do gene durável por até sete dias em esferóides linha de células cancerosas. Existem vários passos críticos para o protocolo que requerem optimização antes de uma tela de siARN pode ser realizada. A capacidade para formar esferóides viáveis ​​reprodutíveis em larga escala é essencial. Além disso, umacondições de transfecção ppropriate deve ser rigorosamente optimizada. Sugerimos testando vários reagentes de transfecção diferentes com não-segmentação adequada e matando os controles antes de tentar a tela. Fomos capazes de mostrar que várias linhas celulares de cancro da mama comumente utilizados, ou seja, BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 e JIMT1 eram passíveis de siRNA transfecção. Além disso, nós fornecemos a prova de princípio de dados de rastreio dos 200 genes mais frequentemente mutado no cancro da mama em esferóides BT474, confirmaram a sua dependência de amplificação de HER2 e mutação oncogénica de PIK3CA. Curiosamente, o silenciamento do factor de transcrição FOXO3 resultou numa redução do tamanho do esferóide mas nenhum efeito significativo sobre a viabilidade. FOXO3 é conhecida para regular a resposta à hipóxia, alterando a capacidade metabólica das células cancerosas que lhes permite adaptar-se mais facilmente ao seu ambiente 16. Este papel poderia potencialmente interferir com a leitura viabilidade celular, uma vez que detecta ATP abundância, Um dos principais produtos do metabolismo celular. Em apoio da observação de uma redução no tamanho do esferóide, foi demonstrado que o silenciamento de FOXO3 HeLa em xenoenxertos auditivos crescimento tumoral e induziu apoptose 17. É importante notar que alguns genes podem afectar a capacidade das células cancerosas para reter a sua arquitectura 3D, o que poderia resultar em falsos positivos. Por exemplo, knockdown da caderina-E resultou na dissolução da estrutura esferóide BT474. Esta havia sido relatado usando E-caderina alvo anticorpos 18. Tal como acontece com qualquer plataforma de triagem, alvos potenciais devem ser novamente testados para avaliar a reprodutibilidade do efeito observado. Existem limitações para a técnica, ou seja, a natureza transitória do silenciamento de genes mediada por siRNA. Sustentados silenciando mais de sete dias não era possível com siRNA. A vantagem desta abordagem é que ele pode ser acoplado com vários outros biomacorantes tricas e não apenas aqueles que avaliar a viabilidade esferóide, por exemplo, dando informação espacial de hipóxia esferóide ou células monitoramento em apoptose. Além disso, porque os scans leitor de placas são relativamente rápida e não-invasiva, o impacto de ARNic em tamanho esferóide pode ser avaliado ao longo do tempo em vez de apenas no ponto final experimental. Na verdade, estamos a explorar várias dessas avenidas dentro do nosso pipeline de rastreio. Uma abordagem alternativa que utiliza culturas 3D para identificar novos dependências é o uso de bibliotecas químicas que inibem qualquer um de uma ampla gama de alvos particulares ou famílias de proteínas. Com efeito, Bitler et ai. utilizou essa abordagem orientada para identificar a interação letalidade sintética entre o estado ARID1A e inibidores EZH2 no ovário carcinoma de células claras 19. A descoberta da tecnologia de edição gene CRISPR-Cas9 também permitiu o desenvolvimento de telas genéticos em culturas organï¿½de e in vivo. No entanto, tsua abordagem depende da existência de instalações para animais apropriados e pode ser custo proibitivo 20. Em conclusão, acreditamos que temos delineado um protocolo que mais precisamente modelos o oxigênio e nutrientes gradientes, que são características do microambiente do tumor in vivo, permitindo a identificação de alvos de câncer de romance ou de validação robusta de metas estabelecidas. Além disso, o protocolo pode ser aplicado a qualquer tipo de linha de células que se forma esferóides e, por conseguinte, pode ser utilizado rotineiramente na comunidade de investigação do cancro para telas de ARNsi de alto rendimento.

Os tumores sólidos exibir histológica significativa, a heterogeneidade genética intra-tumoral e micro-ambientais, que apresenta os clínicos com um desafio significativo na capacidade de tratar pacientes com sucesso. A maioria dos modelos utilizados para identificar novas terapias direcionadas não incorporam muitos desses recursos. De facto, as terapias correntes orientadas utilizados na clínica foram desenvolvidos na década passada utilizando abordagens de rastreio que se baseiam em linhas celulares de cancro cultivadas sob condições bidimensionais (2D) de cultura. Embora este trouxe vários sucessos, tais como inibidores do receptor tirosina quinase, está se tornando evidente que os modelos mais complexos de câncer são obrigados a apreciar plenamente os fatores que contribuem para que impulsionam tumorigênese in vivo e aumentar o número de novas terapias que fazem a transição de modelos pré-clínicos para ensaios clínicos. Além disso, é agora bem apreciado que os sistemas de cultura 2D não reflectem emvivo comportamento 1,2. Por exemplo, em tumores vascularizados mal, como a procura de oxigénio e nutrientes, no microambiente superar a oferta, as regiões de alta e baixa entregas desenvolver. A presença de baixos níveis de oxigênio (hipóxia) em tumores, como detectado pela coloração imuno-histoquímica de secções de tumor para os marcadores de hipóxia estabelecidos, como anidrase carbônica IX (CAIX), correlaciona-se com pior evolução clínica no cancro da mama 3,4 características Assim que incorporem tais como hipoxia em modelos de triagem pode melhorar a nossa capacidade de descobrir alvos de drogas novas que serão mais eficazes in vivo. Na verdade, dirigidas com sucesso tumores agressivos que contenham hipóxia é uma prioridade clínica 5. A alteração de rastreio tradicional 2D siRNA, numa tentativa de recapitular com mais precisão os elementos de condições encontradas por células cancerosas no microambiente tumoral, levou à identificação de vários genes thno foram encontrados como sendo importantes para o crescimento do tumor in vivo. Estes incluem telas de genômica funcional realizadas em condições séricos 6, condições de hipóxia 7 e 8 em combinação. Por exemplo, o silenciamento de 6-Phosphofructo-2-Quinase / frutose-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), uma proteína responsável pela regulação da glicólise entrar carbono, somente induziu a apoptose em linhas de cancro da próstata derivadas de metástases, quando cultivada em baixo teor de soro. O silenciamento de PFKFB4 em linhas de células da próstata normais e sob as mesmas condições não teve nenhum efeito, ao passo que, a depleção de PFKFB4 ablated completamente o crescimento de linha celular de cancro da próstata de xenoenxertos 6. Em um painel alargado de linhas celulares de cancro da mama, o silenciamento de mono-carboxilase transportador 4 (MCT4) preferencialmente conduzido para a redução do crescimento da linha de células sob condições de baixo teor de oxigénio. Esta vulnerabilidade foi validado in vivo no cancro da mama linha de células orthotropic xenografts. Talvez o mais impressionante, silenciando de acetil-CoA sintetase 2 (ACSS2), uma enzima responsável pela conversão de acetato em acetil-CoA, número reduzido de câncer de células sob condições de estresse de nutrientes (baixa de oxigênio e soro), mas teve pouco ou nenhum efeito em condições de cultura normais 8. A ablação de ACSS2 impacto no crescimento de xenoenxertos de cancro da próstata e da mama, sugerindo que os gradientes de nutrientes não existem no isolamento dentro do microambiente do tumor e que as células que residem nestas regiões são essenciais para a progressão do tumor 8. Além disso, também ACSS2 verificou-se ser importante no glioblastoma e carcinoma hepatocelular 9,10, sugerindo que o aumento da actividade ACSS2 em tumores pode ser um mecanismo fundamental que suporta o crescimento sob condições desfavoráveis. Colectivamente, estes estudos demonstram que recapitulando as condições encontradas in vivo e realizar telas siRNA permite a identificação de genes essenciais para a sobrevivência de câncer. Como bem como tendo impacto sobre o crescimento de células de cancro 2D nutrientes sob condições de stress, o esgotamento dos genes alvo nestes estudos inibiu o crescimento do esferóide linha celular de cancro, à semelhança do que foi observado em xenoenxertos tumorais 6,8. Assim, esferóides linha celular de cancro conter várias das condições encontradas no microambiente tumoral que conferem sensibilidade ao silenciamento ACSS2. Com efeito, esferóides apresentar gradientes de nutrientes e oxigénio (soro), alterações no pH, tridimensional de contacto célula-célula (3D), mas também, alterações na celeridade proliferativa com as células submetidas a paragem do ciclo celular e apoptose. Isto é exemplificado pela presença de esferóides de cancro de regiões necróticas, uma característica não encontrada na cultura 2D tradicional. esferóides de células de cancro já foram utilizados como modelos mais biologicamente relevantes para rastrear inibidores de moléculas pequenas, mas isto só permite a validação da eficácia do composto ou reaproveitamento de COMPOunds originalmente projetar para outras doenças 11. métodos de rastreio esferóide actuais não permitem a análise da depleção de gene específico de uma de alto rendimento de modo de alta conteúdo. Aqui, nós descrevemos, pela primeira vez, um oleoduto genómica funcional para a descoberta de genes específicos dependências utilizando a tecnologia de pequeno ARN interferente (siRNA) em esferóides linha celular de cancro. Nós projetamos uma biblioteca sob medida com siRNAs segmentação dos 200 genes mais frequentemente mutado em cancros da mama humanos e avaliou o impacto do esgotamento gene do tamanho do esferóide e da atividade metabólica em BT474 esferóides de câncer de mama. Fomos capazes de detectar de forma robusta e reproduzível do impacto da ErbB2 e PIK3CA silenciando em culturas 3D. Além disso, pode-se avaliar o impacto da depleção do gene na arquitectura espacial dos esferóides BT474 usando imuno-histoquímica.

<table><tbody><tr><td>Lullaby</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&amp;nbsp;</td><td>lipid-based transfection reagent</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>virus-like polymer transfection reagent</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plate</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>96 well plate</td></tr><tr><td>Foil plate seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Luminescent cell viability dye</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1, 000 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (10 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Feta bovine serum</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Cherry picked library</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert Inverted brightfield microscope</td><td>Zeiss</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Incubator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mulitichannel pipette</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures

A identificação de eventos excitador funcionais no câncer é fundamental para aprofundar nossa compreensão da biologia do câncer e indispensável para a descoberta da próxima geração de novos alvos de drogas. Está se tornando evidente que os modelos mais complexos de câncer são obrigados a apreciar plenamente os fatores que contribuem para que impulsionam tumorigênese in vivo e aumentar a eficácia de novas terapias que fazem a transição de modelos pré-clínicos para ensaios clínicos. Aqui apresenta-se uma metodologia para a geração de esferóides tumorais uniforme e reprodutível, que pode ser submetido a triagem funcional de siRNA. Estes esferóides exibir muitas características que são encontradas em tumores sólidos que não estão presentes na cultura bidimensional tradicional. Mostramos que várias linhas celulares de cancro da mama comumente utilizados são passíveis de este protocolo. Além disso, nós fornecemos a prova de princípio de dados utilizando a linha de células de cancro da mama BT474, confirmando a suadependência de amplificação do receptor do factor de crescimento epidérmico e HER2 mutação de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato-3-quinase (PIK3CA), quando crescidas como tumores esferóides. Finalmente, somos capazes de investigar e confirmar o impacto espacial destas dependências usando imuno-histoquímica.

Os ensaios de ligação em placas de esferóide ultra-baixas de 96 poços fornecer uma avaliação fenotipica de alta capacidade para o potencial de oncogenicidade em um contexto, que mais facilmente recapitula as condições fisiológicas encontradas em tumores in vivo. De fato, as linhas celulares de cancro MCF10DCIS.com e forma BT474 estruturas esferóides apertadas (Figura 1A) e investigação imuno das secções esferóides mostrou mudanças espaciais distintas na morfologia celular e nuclear. Ao longo do tempo, alguns, tais como os esferóides esferóides BT474 desenvolver regiões necróticas, uma característica comum de tumores sólidos agressivos (Figura 1B). Alguns esferóides não desenvolvem múltiplos centros necróticos, tais como a linha celular MDA-MB-231, mas exibem variação marcada na marcador proliferativa Ki67, que inversamente correlacionada com a expressão clivado caspsase-3, um marcador de apoptose (Figura 1C). Para estabelecer que várias linhas de células são, de facto receptiva para BT474 silenciamento de genes mediada por ARNsi, MCF10DCIS.com, células JIMT1 MDA-MB-231 e foram transfectadas com ARNsi inversa durante sete dias. A presença de reagente de transfecção (simulado) ou a transfecção de siRNAs de controlo não teve nenhum efeito sobre a viabilidade esferóide, enquanto o silenciamento do gene essencial Ubiquitina B (UBB) reduziu significativamente a viabilidade esferóide em todas as linhas celulares testadas (Figura 1D). Nós projetamos uma biblioteca siRNA humana que englobava os genes mais frequentemente mutados em desmarcada, ER +, HER2 + e triplo cânceres de mama negativos. Essa biblioteca consiste em genes de função conhecida, tais como MYC, PIK3CA e TP53 e aqueles cuja contribuição para a carcinogénese não está estabelecida. A tela também contém vários siRNAs controle-voltados para os não (Controle # 1, Controle # 2) e siRNAs segmentação genes essenciais, tais como PLK1 e UBB, que atuam como matando controles (Tabela 1). Nós escolhemos usar o canc de mamaer linhas de células BT474 em que prontamente formam esferóides sem a adição de membrana basal reconstituída, são estabelecidas linhas de células laborioso e têm uma arquitectura genómica conhecido. Por exemplo, as células BT474 são positivos para o receptor de estrogénio (ER +), sobre-expressam o receptor humano de crescimento epidérmico fator 2 (HER2 +) e mutações do porto em TP53 (E285K) e PIK3CA (K111N) 13. Empregando-se o protocolo descrito acima, que acompanhou a depleção teve impacto gene do tamanho do esferóide e a viabilidade depois de sete dias de siRNA transfecção inversa (Figura 1E). Curiosamente, a maioria dos genes não têm um efeito significativo sobre a área de esferóide ou viabilidade (Figura 2A). Silenciamento de FOXO3, PIK3CA, ErbB2 e SF3B1 resultou na redução reproduzível mais significativa no tamanho do esferóide. Esta redução também foi observada em esferóide viabilidade após ErbB2 e SF3B1 silenciamento. Encorajador, que confirmed o impacto de PIK3CA, ErbB2 e SF3B1 silenciamento do tamanho do esferóide utilizando microscopia de campo brilhante (Figura 2B). Nós previamente identificado SF3B1 como um gene essencial em numerosos modelos de linhas celulares e, portanto, siSF3B1 representa um bom controlo matança para além UBB 14. Curiosamente, todos os 200 genes de apenas o silenciamento de caderina-E, resultou num aumento significativo na viabilidade esferóide (Figura 2A). Investigação da morfologia esferóide mostrou que a caderina-E silenciamento resultou numa desagregação completa da arquitetura esferóide, com células viáveis que descansa na parte inferior do acessório bem baixo (Figura 2B). novo inquérito manual dos dados da tela do volume esferóide mostrou que este também tinha sido observada, mas tinha sido eliminado da área quantificação devido ao objeto que está sendo acima das restrições de tamanho definido. Como destacado anteriormente, as células BT474 sobre-expressam o receptor tirosina quinase HER2 e abrigar uma mutação oncogénica em<html> PIK3CA (K111N). Confirmou-se que o silenciamento de ErbB2 e PIK3CA resultou em viabilidade esferóide reduzida, enquanto a transfecção com controlos não segmentação não teve nenhum efeito (Figura 2C). Em seguida, investigamos o impacto do esgotamento siRNA na histologia esferóide. esferóides BT474 foram transfectadas reverso com não-alvo siRNA controle e siRNAs segmentação PIK3CA, ErbB2 e UBB. O silenciamento de ErbB2 e UBB resultou numa redução do marcador pró-proliferativa de Ki67 em comparação com ARNsi de controlo (Figura 2D). A activação do pró-apoptótica marcador clivada da caspase-3 foi apenas observada após UBB silenciamento, sugerindo que a depleção de HER2 e PIK3CA não resultaram em apoptose, mas eram em vez de citotóxico citostático. Com efeito, o silenciamento de HER2 e PIK3CA deu origem a um aumento da expressão da proteína p27 da proteína de paragem do ciclo celular em comparação com o controle esferóides transfectadas. ENT &quot;FO: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Tomados em conjunto, estes resultados mostram que as células BT474 são accionados por oncogénica HER2 e PIK3CA sinalização, quando cultivada como esferóides 3D Mais importante, estes resultados mostram que é possível. projetar e implementar uma biblioteca de triagem siRNA bespoke de centenas de genes em esferóides de linha de células de câncer robustamente e reprodutível. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig1.jpg" /> Figura 1: Optimização celular Linha de crescimento 3-dimensional. A. As linhas celulares de cancro da mama, MCF10DCIS.com e BT474 foram cultivadas em placas de fixação baixas durante 7 dias. as imagens de campo claro representativos foram feitas usando um microscópio invertido. Barras de escala = 100 pm. B. esferóides MCF10DCIS.com e BT474 foram cultivadas durante 28 dias. 100 ul de meio fresco foi reabastecido a cada 3 - 4 dias. Esferóides foram fixados em 3,8% de formaldeído, embedded, seccionado e corado com hematoxilina e eosina (H &amp; E). Imagens representativas são mostrados em baixo e alta ampliação. As barras de escala representam 33 e 100? M? M, respectivamente. C. MDA-MB-231 esferóides foram cultivadas durante 21 dias. 100 ul de meio fresco foi reabastecido a cada 3 - 4 dias. Os esferóides foram fixadas em 3,8% de formaldeído, embebida, seccionados e corados com Ki67 e caspase-3 clivada. Imagens representativas são mostrados. Barras de escala = 100 pm. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, e JIMT1 linhas de células foram transfectadas com reversa (apenas o reagente de transfecção) simulada e os siRNAs de controlo e UBB, placas ultra-baixas de fixação foram então centrifugada para formar esferóides. meio fresco (100 uL) adicionou-se nos dias 1 e 4. Após 7 dias, a viabilidade celular foi quantificada. Os dados representam a média ± DP de duas réplicas biológicas independentes realizadas em triplicado normalizadas para controlar # 1. A significância estatística foi calculada usando uma UNPAEstudantes IRED teste t (p &lt;0,05). E. Um diagrama de fluxo resume o protocolo de transfecção inversa usado para interrogar funcionalmente dependência gene em esferóides linha de células cancerosas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig2.jpg" /> Figura 2: Investigação Genómica Funcional de BT474 Spheroids Descobre Oncogênicos Dependências. A. Células BT474 foram transfectadas com a biblioteca reversa siARN siGENOME humano 200-gene em triplicado. Observou tamanho esferoidal e viabilidade. Valores de dados em bruto foram normalizados placa e escores z médios foram calculados para identificar valores atípicos significativos superiores a 1,7 vez o desvio padrão da placa mediana de 15. Nota genes periféricas ERBB2, SF3B1, PLK1 e UBB umnd E-cad. siRNAs que significativamente aumentados ou reduzidos área esferóide e viabilidade são sombreadas em azul e vermelho, onde o vermelho representa os siRNA de controle de. B. As células foram transfectadas inversa com o controle não-alvo, a caderina-E (E-Cad), PIK3CA, ERBB2 ou UBB siRNA e, em seguida, girou em uma placa de ultra-baixo apego à forma esferóides. Após 7 dias, as imagens de campo claro esferóides representativos foram feitas usando um microscópio invertido. Barras de escala = 100 pm. C. As células foram transfectadas reverso com não-alvo de controle, PIK3CA, ERBB2 ou UBB siRNA e, em seguida, girou em uma placa de ultra-baixo apego à forma esferóides. Após 7 dias, a viabilidade celular foi quantificada. Os dados representam a média ± DP de duas réplicas biológicas independentes realizadas em triplicado normalizadas para controlar # 1. A significância estatística foi calculada usando um Estudantes teste t não emparelhado (p &lt;0,05). D. Depois de 7 dias, esferóides foram fixados, embebidos, seccionados e coradospor H &amp; E, Ki67, caspase-3 clivada, e p27. Imagens representativas são mostrados. Barras de escala = 100 pm. Note-se a H &amp; E dos esferóides siControl parecer menor devido a um artefacto de esferóides de processamento e individuais intacta escolhidos para a coloração. No entanto, isto não diminui as mudanças observadas com as imagens digitalizadas e os resultados de viabilidade celular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Não-alvo 1 </td><td> TP53 </td><td> DST </td><td> KMT2C </td><td> não tratada 1 </td><td> FCGBP </td><td> ARID1B </td><td> FBXM7 </td><td> TTC40 </td><td> Não-alvo 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GATA3 </td><td> TTN </td><td> MUC12 </td><td> MUC4 </td><td> AHNAK </td><td> HUWEI1 </td><td> DNAH11 </td><td> itpr2 </td><td> ABCA13 </td><td> CREBBP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MAP2K4 </td><td> PIK3CA </td><td> F5 </td><td> APOB </td><td> ANKRD30A </td><td> MUC17 </td><td> DNAH17 </td><td> LAMA2 </td><td> ÁS </td><td> CSMD2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> STARD9 </td><td> USH2A </td><td> FAT3 </td><td> LPR2 </td><td> CSMD3 </td><td> MYO18B </td><td> DNAH5 </td><td> MDN1 </td><td> ARHGAP5 </td><td> DNAH9 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CXCR3 </td><td> MUC16 </td><td> RB1 </td><td> PKHD1L1 </td><td> DNAH2 </td><td> SYNE2 </td><td> DYNC1H1 </td><td> PCLO </td><td> CACNA1B </td><td> ERBB2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> SYNE1 </td><td> lyst </td><td> PTEN </td><td> SPTA1 </td><td> não tratada 2 </td><td> BVS </td><td> RYR1 </td><td> COL6A3 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Não-alvo 1 </td><td> ENAM </td><td> RYR2 </td><td> BRCA2 </td><td> não tratada 1 </td><td> FMN2 </td><td> HECW1 </td><td> LAMB4 </td><td> SI </td><td> Não-alvo 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> FHOD3 </td><td> MACF1 </td><td> RYR3 </td><td> C2ORF16 </td><td> DMD </td><td> FRG1 </td><td> HERC2 </td><td> MYH11 </td><td> STAB1 </td><td> ZDBF2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GOLGA6L2 </td><td> NEB </td><td> SMG1 </td><td> CACNA1E </td><td> DNA14 </td><td> GCC2 </td><td> HIVEP2 </td><td> NIPBL </td><td> TANC1 </td><td> ZNF536 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HMCN1 </td><td> NF1 </td><td> UBR5 </td><td> CACNA1F </td><td> DYNC2H1 </td><td> GON4L </td><td> HYDIN </td><td> PKD1L1 </td><td> TF </td><td> ANK3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HRNR </td><td> OBSCN </td><td> USP34 </td><td> CYMA5 </td><td> FAM208B </td><td> GPR112 </td><td> ITSN2 </td><td> RNF213 </td><td> TPR </td><td> ASPM </td><td></td></tr><tr><td></td&gt; <td> PLK1 </td><td> PCDH15 </td><td> XIRP2 </td><td> COL7A1 </td><td> FLG2 </td><td> não tratada 2 </td><td> BVS </td><td> SAGE1 </td><td> UNC80 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Não-alvo 1 </td><td> DCHS2 </td><td> MUC5B </td><td> ZFHX4 </td><td> não tratada 1 </td><td> MYO9A </td><td> SPHKAP </td><td> CXORF22 </td><td> NCOR1 </td><td> VPS13D </td><td></td></tr><tr><td></td><td&gt; ATR </td><td> DMXL2 </td><td> MXRA5 </td><td> ANK2 </td><td> KIAA1210 </td><td> PRUNE2 </td><td> TCHH </td><td> DANH6 </td><td> NOTCH2 </td><td> ANKRD12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> BIRC6 </td><td> DNAH10 </td><td> TENM1 </td><td> caixa eletrônico </td><td> LRP1 </td><td> SCN10A </td><td> VPS13C </td><td> DNAH7 </td><td> SPEN </td><td> C5ORF42 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CDH1 </td><td> DNAH3 </td><td> PEG3 </td><td> DIDO1 </td><td> MAP1A </td><td> ScN2a </td><td> IPTR3 </td><td> ErbB3 </td><td> SRRM2 </td><td> CCDC88A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CUBN </td><td> NOCK11 </td><td> RELN </td><td> DNAH8 </td><td> MED12 </td><td> SHROOM2 </td><td> CEP350 </td><td> FAT4 </td><td> SZT2 </td><td> CC4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> EYS </td><td> SACS </td><td> KIAA1109 </td><td> MED13 </td><td> não tratada 2 </td><td&gt; BVS </td><td> KMT2A </td><td> VPS13A </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Non-targeting </td><td> QSER1 </td><td> ARID1A </td><td> WDFY3 </td><td> não tratada 1 </td><td> sdk1 </td><td> TEX15 </td><td> LAMA1 </td><td></td><td> Não-alvo 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> COL14A1 </td><td> SHROOM3 </td><td> ATRX </td><td> EFCAB5 </td><td> SF3B1 </td><td> CBFB </td><td> AHNAK2 </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> CSMD1 </td><td> TBX3 </td><td> KIAA0947 </td><td> FOXA1 </td><td> itpr1 </td><td> DDX3X </td><td> KIF4A </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MEFV </td><td> UBR4 </td><td> MYCBP2 </td><td> INPPL1 </td><td> FLG </td><td> HECTD4 </td><td> FAT2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MGAM </td><td> VCAN </td><td> NBEAL1 </td><td> MAP3K1 </td><td> AKAP9 </td><td> GPR98 </td><td> FOXO3 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> ZNF462 </td><td> SETX </td><td> NRP1 </td><td> HERC1 </td><td> não tratada 2 </td><td> BVS </td><td></td><td></td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: layout da placa e siRNA Humano Biblioteca De-convolução. A tabela contém o conteúdo de cada uma das piscinas de siRNA e disposição para as placas baixas de fixação utilizados na tela.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

utilizing-functional-genomics-screening-to-identify-potentially-novel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K visualizações.  The Institute of Cancer Research. Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Vídeo: Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Pesquisa do câncer

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Bioengenharia

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Triagem em escala genômica para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1), MPNSTs are the most common malignancy and the leading cause of death. These rare and aggressive soft-tissue sarcomas offer a stark future, with 5-year disease-free survival rates of 34-60%. Treatment options for individuals with MPNSTs are disappointingly limited, with disfiguring surgery being the foremost treatment option. Many once-promising therapies such as tipifarnib, an inhibitor of Ras signaling, have failed clinically. Likewise, phase II clinical trials with erlotinib, which targets the epidermal growth factor (EFGR), and sorafenib, which targets the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), platelet-derived growth factor receptor (PDGF), and Raf, in combination with standard chemotherapy, have also failed to produce a response in patients. 
In recent years, functional genomic screening methods combined with genetic profiling of cancer cell lines have proven useful for identifying essential cytoplasmic signaling pathways and the development of target-specific therapies. In the case of rare tumor types, a variation of this approach known as cross-species comparative oncogenomics is increasingly being used to identify novel therapeutic targets. In cross-species comparative oncogenomics, genetic profiling and functional genomics are performed in genetically engineered mouse (GEM) models and the results are then validated in the rare human specimens and cell lines that are available. 
This paper describes how to identify candidate driver gene mutations in human and mouse MPNST cells using whole exome sequencing (WES). We then describe how to perform genome-scale shRNA screens to identify and compare critical signaling pathways in mouse and human MPNST cells and identify druggable targets in these pathways. These methodologies provide an effective approach to identifying new therapeutic targets in a variety of human cancer types.

Autor em destaque: Encontrando novos alvos terapêuticos para tumor maligno da bainha do nervo periférico por meio de telas de shRNA em escala de genoma 

We have developed a cross-species comparative oncogenomics approach utilizing genomic analyses and functional genomic screens to identify and compare therapeutic targets in tumors arising in genetically engineered mouse models and the corresponding human tumor type.

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

Resumo

Explore mais vídeos

PLAYLIST