Este trabalho foi financiado em parte por uma fundos de apoio Grant Research (RSFG) da Universidade de Indiana University-Purdue, Indianapolis, e em parte por um prêmio da American Heart Association 14GRNT20390154, a ARK

1. Expressão Bacteriana. Nota: Os plasmídeos de expressão usados neste estudo estão descritos na Tabela 1. Soluções, meios, e tampões utilizados neste estudo estão descritos na Tabela 2. A clonagem de genes de subunidade de proteassoma e archaea a geração de plasmídeos de expressão são descritos noutro local 18,20. Em resumo, os plasmídeos para a co-expressão recombinante de subunidades empregar uma estratégia operão bicistrónico que ajuda na obtenção de níveis de expressão comparáveis de subunidades individuais 18,20. Os parâmetros de expressão enumerados abaixo foram empiricamente determinada como sendo óptima para as subunidades de proteassoma do presente estudo. Pode ser necessário optimizar a expressão de outros mutantes de proteassoma, por proteossomas de outras espécies de arqueia, ou para outros complexos de proteína recombinante (ver discussão). <ol><li> Transformar o plasmídeo de interesse expressão em E. coli quimicamente competentes BL21 (DE3) células. </li><li> Adicionar 1 - 2 ul de plasmídeo (tipicamente 50 - 100 ng) a uma alíquota de células DE3 que foram recém-descongeladas em gelo, e continuar a incubar em gelo durante 20 min. </li><li> O choque térmico das células a 42 ° C durante 45 s e retornar tubo para gelo para additionl 2 min. </li><li> Adicionar 1 ml de meio LB e incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante 1 h. </li><li> Espalhe 100-200 uL da mistura de transformação em LB-kan placas (placas contendo meio LB sólidos, suplementadas com canamicina (todos os plasmídeos usados ​​neste estudo codificam resistência a este antibiótico)). Incubar as placas a 37 ° C O / N. </li><li> Na manhã seguinte, inocula uma única colónia da placa de LB-kan em 3 ml de meio LB-kan líquido num tubo de cultura de vidro. Incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante cerca de 2,5-3 horas, ou até a turbidez é observado. </li><li> Medir a densidade óptica da cultura a 600 nm (DO600) num espectrofotómetro. Diluir o culto celularure com uma quantidade apropriada de meio LB-kan pré-aquecido a uma DO 600 de 0,4, num volume final de 6 ml. Retomar a agitação a 37 ºC durante 40 min. </li><li> Induzem a expressão de proteínas nas culturas líquidas pela adição de IPTG a partir de uma solução-mãe a uma concentração final de 1 mM. Incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante cerca de 6-7 h. </li><li> Colher culturas de células bacterianas, na sua totalidade em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 1,5 ml de uma cultura em tubo de microcentrifugação. Centrifuga-se a 10000 × g durante 1 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar mais 1,5 ml da mesma cultura ao sedimento. Centrifuga-se a 10000 × g durante 1 min. </li><li> Repetir o passo 1.11 até que toda a cultura é colhida no tubo de microcentrífuga. </li><li> Armazenar as pelotas induzidas a -80 ° C até a lise. </li></ol> 2. Lise bacteriana e Lisado de mistura. Nota: </strong&gt; Para amostras estudadas através de co-expressão, siga secção 2.1 (e suas subseções). Para amostras que necessitam de mistura lisado, siga secção 2.2 (e suas subseções). A análise de TSP (total, solúvel, pastilha) que está incluído no protocolo é útil na optimização da expressão da proteína que pode ajudar a garantir que quantidades aproximadamente iguais de subunidades a e p são combinadas durante o lisado de mistura (ver discussão). Ele também fornece um controle importante se resultados inferiores não são como esperado (ou seja, ele verifica que a proteína foi expressa e solúvel). Assim, recomendamos incluindo análise TSP inicialmente. Uma vez que um protocolo ideal foi alcançado para uma combinação subunidade particular, a análise TSP não é estritamente necessário, que é por isso que ela é descrita como opcional abaixo. <ol><li> A lise das células bacterianas e preparação de fracções solúveis. <ol><li> Descongelar o sedimento celular induzida em gelo durante 5 min. Ressuspender o sedimento em 600 ul de tampão de lise. </li><li> IncUbate a suspensão a 30 ° C com agitação (150 rpm) durante 30 min para gerar lisado bruto total. Nota: A etapa seguinte e a subseção que se segue são opcionais. </li><li> Retire os dois 25 mL alíquotas a partir do ligado brutas totais em 1,5 tubos separados microcentrífuga ml e realizar análises TSP como segue. <ol><li> Para uma das duas aliquotas de 25 ml, adicionar tampão de amostra 5X de SDS para uma concentração final de 1X. Rotular o tubo com &quot;T&quot; para o &quot;total de lisado bruto&quot;. </li><li> Incubar o &quot;T&quot; da amostra a 100 ° C durante 5 minutos para desnaturar proteínas completamente. </li><li> Enquanto isso, pegue a segunda alíquota de 25 mL e centrifugar-lo a 10.000 × g por 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pequena pelota, e transferi-lo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Marque esse novo tubo &quot;S&quot; para &quot;fracção solúvel&quot;. </li><li> Para os restantes behi pequena sedimentoND na etapa anterior, adicionar 25 ul de tampão de lise e vortex para ressuspender. Rotular este tubo &quot;P&quot; para &quot;fração pellet&quot;. </li><li> Adiciona-se 6 mL de tampão de amostra 5X de SDS para os &quot;S&quot; e &quot;P&quot; tubos e incuba-se a 100 ° C, como descrito acima. Nota: Se as amostras TSP não irá ser utilizado naquele dia para analisar a expressão, que pode ser congelada a -20 ° C até ser necessário. Uma vez descongelado, eles devem ser novamente incubada a 100 ° C, como acima descrito, imediatamente antes do carregamento num gel de SDS-PAGE padrão 12% e / ou 15%. </li></ol></li><li> Enquanto a análise de TSP é levada a cabo, de centrifugação da restante 550 mL de lisado bruto total (ou a totalidade do 600 ul de lisado bruto total, se a análise do TSP é não realizado) a 10000 × g durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco. Este é o lisado solúvel que irá ser utilizada para a purificação. </li></ol></li><li> mistura lisado. <ol><li> Realizar a lise conforme descrito nos passos 2.1.1 e 2.1.2 supra. </li><li> Misturar 600 mL de lisado bruto total desde bactérias que expressam a subunidade α desejado com 600? L de lisado bruto total desde bactérias que expressam a subunidade β desejado. Incubar a 37 ºC com agitação lenta durante 30 minutos. Nota: Pode ser necessário para otimizar o tempo de incubação para alcançar o máximo de montagem durante lisado de mistura (ver discussão). O tempo ea temperatura apresentadas aqui são ideais para as proteínas recombinantes neste estudo e foram determinados em outro lugar 18. </li><li> Centrifugar o lisado misturada a 10000 × g durante 10 min para separar o material solúvel do sedimento insolúvel. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. Utilize este ligado solúvel misto para a purificação de proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Purificação de Proteínas Imobilizadas cobalto através de afinidade em resina(ICAR). <ol><li> Equilibrar a resina. <ol><li> Completamente ressuspender a resina, invertendo o frasco e transferir 50 ul da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifuga-se a 700 x g durante 2 min para resina de sedimento. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Nota: realizar a aspiração da pipeta usando um azul ponta de pipeta de 1 mL para remover a maior parte do líquido. Uma dica 2 mL branco é usado para controle de multa de remoção do sobrenadante restante, deixando uma camada muito fina de líquido de cobertura das esferas. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão A. Misture suavemente para voltar a suspender resina e centrifugar a 700 × g durante 2 min para sedimentar resina. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e repetir este passo de lavagem mais uma vez. </li></ol></li><li> Aplicar ligado solúvel obtido anteriormente na seção 2.1 ou 2.2 para a resina equilibrada. Incubar o tubo com uma rotação suave a 4 ºC durante 60 min. Centrifugar o tubo a 700 × g &lt;/ Em&gt;, durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. </li><li> Lava-se a resina como se segue para remover as proteínas não especificamente ligadas. <ol><li> resina Ressuspender com 1 ml de tampão A e incubar com agitação suave a 4 ºC durante 10 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. Repita este passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Ressuspender a resina com 1 mL de Tampão B (Tampão A com imidazole a 5 mM) e incuba-se com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. Repita este passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Ressuspender a resina com 1 mL de tampão C (tampão A com imidazole 10 mM) e incuba-se com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. </li></ol></li><li> Elui-se a proteína por adição de 400 uL de tampão E (tampão A com imidazole 200 mM) tO da resina. Incube com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se a 700 x g durante 5 min. </li><li> Transferir o sobrenadante contendo proteína purificada para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Dessalinizar a proteína purificada por centrifugação em série como se segue. <ol><li> Para 400 uL de proteína purificada, adiciona-se 100 uL de tampão A (isto reduz a concentração de imidazole de 200 mM a 160 mM). Aplicar proteína purificada a 0,5 ml de ultra-centrifugaï¿½o filtros com um peso molecular de 10 kDa de corte. Centrifuga-se a 14000 × g durante 5 min. </li><li> Descartar o filtrado e adicionar 400 uL de Tampão A para diluir o retentado e centrifugar novamente. Continue os ciclos de centrifugação / diluição até concentração de imidazol cai abaixo de 4 mM. Como um exemplo, se cada centrifugação concentra-se 500 ul para baixo para ~ 70 ul (ou de aproximadamente 7 vezes), em seguida, dois ciclos irá reduzir a concentração de 160 mM a partir de imidazole (7 × 7 = 49 vezes) para approximately 3,3 mm. </li><li> Medir a concentração de proteína da amostra dessalinizada usando o ensaio BCA 21. Nota: A dessalinização é necessária para reduzir os níveis de imidazole abaixo do limite de tolerância para o ensaio de BCA, tal como descrito nas instruções do fabricante. O nosso laboratório prefere o ensaio BCA porque é sensível, tem uma grande faixa dinâmica, e exibe muito menos variação proteína-proteína. No entanto, outros métodos para determinar a concentração de proteína pode ser substituído para o ensaio de BCA. A chave é estar ciente das vantagens e limitações de cada método. </li></ol></li><li> Adicionar tampão de amostra 5X nativo a uma concentração final de 1X e proceder-se a electroforese. Alternativamente, armazenar amostras a -20 ºC para análise posterior. </li></ol> 4. não desnaturante em gel de poliacrilamida eletroforese (PAGE). Cuidado: acrilamida não polimerizado é uma neurotoxina. Desgaste gea de protecção adequador. <ol><li> Prepara-se o gel de PAGE não desnaturante como se segue. <ol><li> Prepare a cassete de gel para o vazamento usando placas de vidro limpas e lançando suporte. Coloque fabricante de gradiente no topo de um pequeno agitador magnético e coloque uma pequena barra de agitação em cada câmara. </li><li> Usando 40% (w / v) de acrilamida e de 2% (w / v) de soluções stock bisacrilamida, preparar 5% e 10% (w / v) de soluções de gel de acrilamida em um tampão de resolução nativa. Assegure-se que a razão de acrilamida para bisacrilamida totais é de 37,5: 1. Frio em gelo antes do vazamento. Nota: O sistema não desnaturante PAGE usado aqui é essencialmente idêntico ao sistema de SDS-PAGE de Laemmli, com SDS omitido 22. </li><li> Adicionar persulfato de amónio (de 10% (w v) / solução de estoque preparadas em água) para as soluções de acrilamida para iniciar a polimerização. A concentração final de persulfato de amónio é de 0,1% (w / v). </li><li> Despeje a solução de acrilamida para as duas câmaras do fabricante de gradiente. Com a b tubulação de saída inseridontre as placas da cassete de gel, activar o agitador magnético e abrir as válvulas fabricante de gradiente. Despeje a 5 - em gel com gradiente não desnaturante a 10%. </li><li> Uma vez vazada, sobrepor o gel com uma camada fina de isopropanol e permitir que o gel para polimerizar durante 30 minutos. Durante este tempo, preparar a solução de gel de acrilamida a 5% fresco em tampão de resolver nativa. Depois de os conjuntos de gel, deitar fora isopropanol e lavar a superfície do gel, com água desionizada a partir de uma garrafa de esguicho. </li><li> Para a solução de gel de 5%, preparada antes, adicionar persulfato de amónio (exactamente como descrito em 4.1.3) e verter em cima do gel polimerizado até placas de vidro são cheios. Insira pente gel. Permitir que o gel sobreposta para polimerizar durante mais 30 min. </li><li> Uma vez que é de gel polimerizado, montar cassete de gel no aparelho de electroforese. Alternativamente, armazenar o gel a 4 ºC, envolto em toalhas de papel umedecido e filme plástico até que esteja pronto para uso. </li></ol></li><li> Uma vez que não desnaturante em gel PAGE é montada em elecAparelho trophoresis, encher o tanque com tampão de corrida nativa 1X preparada a partir de um estoque regulador execução nativa de 10X. </li><li> Carga de 10 ug de proteína purificada, obtida no final da secção 3, em cada poço usando uma seringa de vidro. </li><li> Carga 2 uL de padrão de peso molecular elevado de proteína nativa (diluído em tampão de corrida nativa 1X) em um dos poços. </li><li> Executar gel a 55 V e 4 ºC até que a frente de corante é executado fora do gel (cerca de 4-4,5 h). </li><li> Em adição ao gel não desnaturante, analisar-se alíquotas da proteína purificada por SDS-PAGE padrão 22. <ol><li> Misturar-se alíquotas (10 ug) das amostras de proteínas purificadas, obtidas no final da secção 3, com tampão SDS-amostra 5X a uma concentração final de 1X. </li><li> Incubar a 100 ºC durante 5 min e carregar no padrão de 12% e / ou 15% de géis de SDS-PAGE 22. </li><li> Executar a 80V durante 20 min e em seguida a 120 V até a frente do corante foge do gel (isto é, aproximadamente, um suplementoitional 75 min para um gel a 12%, e 120 minutos para um gel a 15%). </li></ol></li></ol> 5. Actividade visualização e coloração da proteína. <ol><li> Após a electroforese, as placas de vidro separadas e transferir cuidadosamente o gel não desnaturante para um tabuleiro de gel contendo 50 mL de água desionizada. Lavar o gel com balanço delicado por 5 min. Descarte de água e repita esta etapa de lavagem três vezes. </li><li> Realizar ensaio de sobreposição de substrato como se segue. <ol><li> Adicione 1 mL de desenvolver tampão contendo o substrato peptídeo fluorogénico Suc-LLVY-AMC e espalhe uniformemente sobre o gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min. Nota: Uma vareta de vidro ou de um libertador de gel (pequena cunha de plástico usado para placas de vidro separadas) pode ser usado para espalhar o líquido sobre o gel. </li><li> Transferir cuidadosamente o gel sobre o transiluminador de UV de sistema de imagem do gel e observar fluorescência devida ao substrato péptido clivado. imagem Record. transferir cuidadosamente os ba gelck para a bandeja de gel. </li><li> Lavar o gel duas vezes com 50 mL de água desionizada durante 5 min com agitação suave. </li><li> Corar o gel com 10 ml de um reagente de coloração de Coomassie coloidal durante 60 minutos com agitação suave. gel Destain com 50 mL de água até o fundo se torna claro. Este passo aplica-se a coloração dos géis de SDS-PAGE bem como padrão. </li></ol></li></ol>

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R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nós demonstramos o benefício de uma abordagem combinada à análise de montagem do proteosoma pelo não desnaturante PAGE utilizando proteasomas archaeal recombinantes. O método usual de 9,11 a co-expressão bacteriana de subunidades de proteassoma permite a análise rápida mas pode não revelar intermediários chave de montagem. Sugerimos combinando co-expressão com ligado misturando a desenvolver um quadro mais amplo de eventos de montagem. A vantagem desta abordagem combin...

Complexos multiprotein realizar inúmeras actividades celulares críticas 1. Para muitos desses complexos, muito mais se sabe sobre sua estrutura e função do que cerca sua montagem 2,3. O proteassoma é um tal complexo e é encontrado em todos os domínios da vida. Em eucariotas, esta máquina molecular está no cerne do Sistema Proteasoma / ubiquitina (UPS) e fornece a principal via de degradação da proteína intracelular 4. O proteassoma eucariótica (referido como o proteassoma 26S) é composto de duas principais subconjuntos: um proteassoma 20S, ou partícula central (CP) 5, que pode ser tapado com uma ou ambas as extremidades por uma partícula de regulamentação 19S (RP) 6. O proteassoma 20S é um grande protease compartimentada. A sua estrutura quaternária é absolutamente conservado em todos os domínios de vida e consiste de uma pilha de quatro anéis de sete membros contendo dois tipos de subunidades estruturalmente relacionadas, α; e p 5,7,8. Nos eucariotas, os dois anéis exteriores são cada um composto por sete sub-unidades a distintas, e os dois anéis interiores são cada um composto por sete subunidades p diferentes; actividade proteolítica reside dentro de três das subunidades p. Em contraste, os anéis de CP arquebactérias e bactérias são geralmente composta por apenas um tipo de α e um tipo de subunidade β. Proteasomas Arqueais forneceram um importante sistema modelo para estudar a montagem do proteassoma devido tanto à sua simplicidade de composição e sua partilha de um mecanismo de montagem comum com os seus homólogos eucarióticos 9-13. Em breve, subunidades a montar em anéis alfa em primeiro lugar, que servem como um andaime sobre o qual p subunidades montar. As meias-proteassomas resultantes (7 α β 7) dimerizar, dando origem a CP totalmente montado (α β 7 7 7 β α 7). Durante a dimerização, os pró-péptidos apresentar em subunidades psão autocataliticamente removida, expondo as treoninas N-terminais catalíticas. A utilização de proteossomas de arqueia para modelar montagem frequentemente leva vantagem de a produção de proteínas recombinantes de proteassoma de arqueia em Escherichia coli. Esta é uma abordagem útil porque permite que as subunidades a ser produzidos em várias combinações, como tanto a WT e versões mutantes, num organismo hospedeiro que não produz as suas próprias proteossomas. Acompanhamento do conjunto de complexos multi-protéicos requer bioquimicamente algum tipo de método de fraccionamento que separa complexos totalmente montados a partir de intermediários de montagem e precursores. Devido à sua capacidade de resolução superior, não desnaturante em gel de poliacrilamida de electroforese (PAGE), tem provado ser especialmente úteis no fraccionamento de vários grandes complexos multiproteicos 14-17. A combinação de produção proteassoma archaeal recombinante e PAGE não desnaturante tornou-se uma abordagem poderosa em dissecting de montagem do proteassoma 9,11,12,18. No entanto, o método usual, através da qual esta abordagem é aplicada (isto é. Por meio da co-expressão recombinante de subunidades a e p) tem uma importante desvantagem. Reações de montagem são cooperativos e fortemente dependente da concentração 3. Dado que a concentração de proteínas no interior das células é muito alta 19, devido a efeitos de volume excluído, reacções de montagem proceder rapidamente in vivo. Por isso, é possível perder importantes intermediários de montagem quando aep subunidades são co-expressos. Aqui, defendem uma abordagem combinada no estudo da montagem do proteassoma usando subunidades de proteassoma archaeal recombinantes. Nesta abordagem, ambos os métodos de mistura e co-expressão de lisado são empregues. O ex-permite a análise rápida de reunião, porque a co-expressão é menos trabalhosa. Este último depende da expressão separada de subunidades a e p, seguidos por mistura. Embora este requires um pouco mais esforço do que co-expressão, é mais do que compensada pela capacidade de detectar intermediários que são perdidas durante a co-expressão. Juntos, estes dois métodos podem fornecer um quadro mais completo de montagem do proteassoma.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteossomas são encontrados em todos os domínios da vida. Eles fornecem a principal via de degradação da proteína intracelular em eucariotas, embora a sua montagem não está completamente esclarecido. Todos os proteasomas conter uma partícula estruturalmente conservada núcleo (CP), ou proteassoma 20S, contendo dois anéis de subunidade beta heptamérico imprensado entre dois anéis de subunidades α heptamérico. Archaea proteosomas 20S são de composição simples em comparação com os seus homólogos eucarióticos, ainda que ambos partilham um mecanismo de montagem comum. Consequentemente, Archaea proteosomas 20S continuam a ser modelos importantes para a montagem do proteassoma eucariótica. Especificamente, a expressão recombinante de 20s archaeal proteasomas juntamente com não desnaturante eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) rendeu muitos insights importantes sobre a biogênese proteassoma. Aqui, discutimos um meio para melhorar a estratégia habitual de co-expressão de α proteassoma e archaea subunidades p antes nondenaturing PAGE. Nós demonstramos que, embora rápida e eficiente, uma abordagem co-expressão por si só pode perder intermediários chave de montagem. No caso de o proteassoma, a co-expressão pode não permitir a detecção da meia-proteassoma, um contendo uma completa α-anel intermédio e uma completa β-anel. No entanto, este intermediário é facilmente detectado por meio de mistura lisado. Sugerimos que a combinação de co-expressão com mistura lisado produz uma abordagem que seja mais aprofundada na análise de montagem, ainda permanece nonintensive trabalho. Esta abordagem pode ser útil para o estudo de outros complexos multiproteicos recombinantes.

Montagem de proteassoma (Figura 1) começa quando sub-unidades a combinam-se para 9 formam anéis. Isto pode ser ilustrado quando subunidades alfa do archaeon Methanococcus maripaludis S2 são expressas em E. coli como C-terminal de hexa-histidina com etiquetas (His-tag) derivados (Tabela 1). Quando o α-His recombinante foi purificada por ICAR e analisadas por PAGE não desnaturante, duas bandas foram observadas (Figura 2A, pista 1). Temos ...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Este protocolo usa tanto co-expressão de subunidades e subunidade postlysis mistura para um exame mais aprofundado do conjunto proteassoma recombinante.

Examinando Assembleia proteosoma com recombinante Archaea proteasomas e não desnaturante PAGE: The Case for uma abordagem combinada

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K visualizações.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Este protocolo usa tanto co-expressão de subunidades e subunidade postlysis mistura para um exame mais aprofundado do conjunto proteassoma recombinante. 

Vídeo: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bioquímica

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biologia

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

Troca específica de resíduo de Proline por Análogos Proline em Proteínas Fluorescentes: Como a "Cirurgia Molecular" da espinha dorsal afeta o dobrável e a estabilidade

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

Bioengenharia

The Proteasome Structure

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no longer needed. In this pathway, the protein that needs to be eliminated undergoes a process called ubiquitination, where a chain of ubiquitin molecules is attached to the 48th lysine residue of the target protein. This ubiquitin modification helps the proteasome distinguish between a target protein and a healthy protein.
The proteasome is an ATP-driven, large multi-subunit protease (26S) found in the nucleus and cytoplasm of all eukaryotes. The 26S proteasome comprises a central hollow cylindrical core (the 20S) and ring-shaped protein caps (19S). The 20S core particle is barrel-shaped, containing stacked rings with proteolytic active sites lined inside. The 19S caps act as gatekeepers and regulatory units of the proteasome. They are present at one or both ends of the core.
Caps have ubiquitin receptors, ubiquitin hydrolase, and unfoldase, each with a unique function. The ubiquitin receptor recognizes and allows ubiquitin-tagged proteins into the core, the hydrolase deubiquitinase cleaves ubiquitin from the substrate, and the unfoldase protein unfolds target proteins as they enter the protein core.
The hexameric unfoldases create a ring structure in the proteasome cap and belong to a large class of AAA proteins. Their mechanistic action is similar to other ATP-dependent helicases that cause DNA unwinding. The ATP-bound unfoldase ring binds a folded target protein held in place by its ubiquitin tag at the proteasomal cap. Next, a conformational change, driven by ATP hydrolysis, pulls the target protein substrate into the 20S core and strains the ring structure. As a result, when a protein is subjected to pulling forces, it can undergo two possible outcomes&#8212; it may either undergo partial unfolding and enter the cylindrical core, or it can retain its structure while partially retracting.
Highly stable substrates generally require hundreds of cycles of ATP hydrolysis before being pulled through the AAA ring. Once de-ubiquitylated and unfolded, the target protein is exposed to proteases inside the proteasomal core for digestion. In contrast to free cellular proteases, which quickly dissociate after their action on the target protein, the proteasome core holds the target protein until it is fully digested into smaller peptides. These small peptides are then released into the cytosol for further processing.&#160;

A Estrutura do Proteassomo

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no ...