Nosso protocolo permite o isolamento e separação de KRAS devidamente processados em alto rendimento. A produção de KRAS autenticamente farnesilado e carboximetilado torna possível realizar experimentos que tenham KRAS em sua membrana, assim como em células de mamíferos. O alto rendimento do protocolo o diferencia do trabalho anterior.
Normalmente purificamos de três a cinco miligramas de proteína por litro de material de expressão. Isso nos permite realizar uma variedade de experimentos biofísicos e estruturais de biologia. O KRAS é mutado em 20% dos cânceres e 90% em cânceres de pâncreas.
Portanto, ter um protocolo para produzir proteínas autenticamente processadas é bastante útil para o desenvolvimento de telas de medicamentos para que você possa estudar a proteína real como seria na membrana das células cancerosas. Este protocolo também é muito útil para estudar outras proteínas que são farnesiladas e totalmente processadas nas células. E como tal, tudo o que você precisa fazer é trocar o KRAS com a proteína de interesse e colocá-lo no baculovírus.
Os passos críticos são aqueles ao redor da cromatografia de troca de cation. Usar a coluna adequada e limitar o tempo em que a proteína está em baixo tampão de sal são essenciais para o sucesso. Entender que a precipitação não é um tipo de evento de globo de neve ajuda a guiar os novos para o protocolo.
Isso é reforçado mostrando a necessidade de dividir a carga da coluna de troca de cation em várias cargas menores. Depois de lise as células, esclarecendo o lise e purificando a proteína alvo pelo IMAC, analise as frações proteicas usando a página SDS e a coloração coomassie. Acumule as frações de pico e digele a piscina durante a noite contra dois litros de tampão D a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, remova a amostra da diálise e centrífuga-a a 4.000 vezes por 10 minutos para remover qualquer precipitado. A amostra final dialisada e clarificada muitas vezes ainda é nebulosa, mas pode ser aplicada à coluna CEX sem maior processamento. Prepare a coluna de troca de 20 mililitros lavando-a com três volumes de coluna de buffer G, depois com três volumes de coluna de tampão F.Next, diluir 20 mililitros da amostra dialisada para uma concentração final de cloreto de sódio de 100 mililitros adicionando 20 mililitros de buffer E e aplicar a amostra na coluna de troca.
É fundamental diluir a pequena quantidade da amostra em vez de todas de uma vez e as amostras diluídas devem ser aplicadas à coluna imediatamente após a diluição para limitar a precipitação da proteína. Continue carregando a coluna com amostra recém-diluída à medida que a diluição anterior se aproxima do fim da carga. Em seguida, lave a coluna para a absorção de linha de base 280 com tampão F que normalmente requerem três volumes de coluna.
Elute a proteína da coluna com um gradiente de 400 mililitros do tampão F a 65% de tampão G, coletando o eluent em seis frações mililitros. Uma vez que o gradiente esteja completo, continue lavando a coluna para um volume adicional de 1,5 colunas de 65% tampão G.Escolha as frações positivas com base tanto na página SDS quanto na análise da mancha Coomassie Blue, bem como na inspeção do traço UV do cromatógrama. Em seguida, acumule a proteína e digere-a com a protease His6 TEV de acordo com as instruções do manuscrito.
Após a digestão e diálise, carregue a proteína em uma coluna IMAC de 20 mililitros equilibrada com tampão A a três mililitros por minuto. Colete sete frações mililitros durante esta cromatografia e lave a coluna com um total de três volumes de coluna de tampão A ou até que a absorção da linha de base seja atingida. Elute a proteína alvo com gradiente de volume de cinco colunas de tampão C de 0%a 10% e coletar sete frações mililitros.
Em seguida, identifique as frações positivas com a página SDS. Quando analisado com a página SDS, o lysate esclarecido deve conter uma faixa escura que migra para cerca de 65 kilodaltons que corresponde à proteína de fusão His6-MBP-tev-KRAS4b. O FNTAb co-expresso migra para 48 kilodaltons.
O passo CEX dentro da purificação é fundamental porque reduz a extensão da proteólise e enriquece a proteína totalmente processada, mas é a parte mais complicada do protocolo. Um resultado típico desta etapa tem um pico de três proeminentes com o KRAS4b-FMe, mas perfis de elução podem ser variáveis. A análise de massa intacta usando ESIMS confirma a massa molecular precisa das proteínas e, assim, a proporção relativa de farnesilização ou carboximetilação.
Embora os lotes finais típicos contiveram alguns KRAS4b-FARN detectáveis, essa proporção foi inferior a 15% em termos de altura máxima a partir desta análise. A análise de massa nativa foi utilizada para determinar a massa do KRAS4b vinculado ao PIB. O solvente amostral foi trocado por acetato de amônio para garantir uma ionização mais suave permitindo que o complexo nativo permanecesse intacto.
A interação de KRAS4b-FMe e lipossomos foi medida com ressonância de plasmon superficial para validar a farnesitilação e carboximetilação são necessárias para que KRAS4b-FMe se ligue às membranas. Como esperado, KRAS4b-FMe ligado aos lipossomos enquanto KRAS4b não processado não. Minimizar o tempo em que a proteína é exposta ao baixo sal é o aspecto mais crítico do protocolo que afeta o rendimento.
A proteína está apenas brevemente nesta baixa concentração de sal após a diluição no buffer E.A proteína pode ser usada para uma variedade de experimentos biofísicos que usam mimetísticas de membrana como lipossomos ou nanodiscos para investigar quais lipídios KRAS interage. Usando esses dados, podemos começar a extrapolar como o KRAS interage com a membrana plasmática da célula. Usando kras-fme purificado, nossos colegas foram capazes de resolver a estrutura de cristal de raios-x do KRAS em complexo com um acompanhante que é específico para a forma farnesilada e metilada desta proteína.
