Agradecemos ao Dr. Guido Scarabelli e Hongyang Li por testes extensivos ao longo do desenvolvimento, bem como a comunidade de usuários Bio3D e os participantes da oficina de bioinformática estrutural da Universidade de Bergen para comentários e comentários que melhoraram esta aplicação.

NOTA: Uma sessão típica da Bio3D-web passa por cinco etapas consecutivas e dependentes (veja a Figura 1 para uma representação esquemática). Cada etapa é implementada como uma guia de navegação consecutiva do aplicativo da Web, a saber, SEARCH, ALIGN, FIT, PCA e eNMA. 1. Pesquisa e seleção de estrutura (PESQUISA) <ol><li> Estrutura de entrada <ol><li> Obtenha o PDB ID da adenilato quinase (Adk), por exemplo , pesquisando o PDB [http://www.rcsb.org/pdb]. Alternativamente, obtenha a sequência de aminoácidos da proteína de interesse, por exemplo , da UniProt [http://uniprot.org]. </li><li> Digite o ID do PDB de quatro caracteres longo para Adk ( por exemplo, 1AKE), ou cole uma seqüência de proteína, na caixa de texto no painel &quot;Entrada de estrutura ou seqüência&quot;. </li></ol></li><li> Hit selection <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Seleção de seleção) no primeiro painel ou simplesmente role para baixo para o painel B) &quot;Selecionar seleção&quot;Para uma análise mais aprofundada. </li><li> Certifique-se de que o controle deslizante &quot;Limite do número total de estruturas incluídas&quot; é definido como seu valor máximo para incluir todas as estruturas acima do ponto de corte. </li><li> Abaixe o &quot;Ajustar o limite de BitScore de inclusão&quot; para incluir sucessos mais distantes ou aumentá-lo para excluir. </li></ol></li><li> Filtragem de sucesso opcional <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (seleção de seleção) no primeiro painel ou simplesmente role para o painel C) &quot;Filtragem opcional de estruturas relacionadas para análise posterior&quot;. </li><li> Certifique-se de que os resultados selecionados representem estruturas relevantes, inspecionando detalhes da tabela, por exemplo , nome PDB, espécies e ligandos encadernados. </li><li> Refine manualmente o subconjunto selecionado de estruturas, se necessário clicando nas linhas da tabela. NOTA: As linhas destacadas com uma cor azul representam IDs do PDB selecionadas para análise posterior nas guias posteriores. </li></ol></li></ol> 2. Análise de Alinhamento de Sequências Múltiplas (ALIGN) <ol><li> Clique na guia ALIGN para executar o alinhamento de seqüência das estruturas selecionadas na guia SEARCH. </li><li> Resumo de alinhamento <ol><li> Revise o resumo do alinhamento no painel A) &quot;Resumo do alinhamento&quot;. Certifique-se de que as regiões de interesse estão alinhadas e não mascaradas por lacunas em uma ou mais estruturas. </li><li> Se necessário, alternar as &quot;Opções de edição do alinhamento da tela&quot; e remover indícios de PDB indesejados, por exemplo , PDBs com resíduos ausentes. </li></ol></li><li> Análise de alinhamento de seqüência <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Análise) para executar a análise de agrupamento baseada em seqüência das estruturas coletadas. </li><li> Selecione a opção de plotagem Dendrograma. Ajuste o Cluster no controle deslizante de grupos K para particionar as estruturas em grupos k. </li><li> Opcionalmente, altere o método de agrupamento, se desejado, ao alternar a caixa de seleção Mais opções de cluster e saída. </li></oL&gt; </li><li> Análise de conservação de resíduos <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Conservação) para calcular a conservação de resíduos em coluna. </li><li> Selecione os conjuntos de estrutura Alinhados para gerar um gráfico da conservação de resíduos em cada posição de alinhamento. </li><li> Selecione Estruturas alinhadas com alinhamento de sementes de PFAM para mostrar a conservação calculada em relação ao alinhamento de sementes de PFAM associado contendo membros representativos da família. </li></ol></li><li> Exibição de alinhamento de seqüência <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Alinhamento) para mostrar o alinhamento da sequência completa com a ferramenta de visualização do alinhamento no navegador. </li></ol></li></ol> 3. Estrutura de montagem e análise (FIT) <ol><li> Execute a superposição da estrutura inserindo a guia FIT. </li><li> Estrutura de superposição <ol><li> Alternar a caixa de seleção &quot;Mostrar PDBs&quot; para visualizar o protegido alinhadoN estruturas no navegador. </li><li> Certifique-se de que as estruturas protéicas se sobrepõem a regiões correspondentes e relevantes por inspeções visuais. Clique e arraste o mouse sobre as estruturas para girar e role para ampliar. </li><li> Ajuste a coloração das estruturas clicando nas &quot;Opções de cor&quot;. As opções de coloração incluem a posição de alinhamento, variabilidade estrutural por posição, grupos de agrupamentos RMSD, grupos de sequências agrupadas, regiões alinhadas e estrutura secundária. </li><li> Faça o download das estruturas superpostas como arquivos PDB convencionais ou como um único arquivo de sessão PyMOL para visualização em um programa de visualizador molecular especializado. </li></ol></li><li> Análise da estrutura <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Análise) para executar o agrupamento baseado em estrutura das estruturas PDB coletadas. </li><li> Alternar o RMSD Heatmap no menu suspenso Opções de traçar. </li><li> Ajuste as opções de agrupamento, incluindo o próprio método de cluster, Ao trocar a caixa de seleção &quot;Mais clustering e opções de saída&quot;. NOTA: Os dados do RMSD em partes podem também ser visualizados como um dendrograma, um histograma ou um mapa de calor. </li></ol></li><li> Flutuações de resíduos <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (RMSF) para ver a variabilidade estrutural de cada resíduo (mostrado como um gráfico RMSF) com elementos de estrutura secundária principais mostrados nas regiões marginais do eixo dos x. </li><li> Alternar a caixa de seleção Mostrar B-fatores para sobrepor os fatores B cristalográficos da estrutura de referência no gráfico RMSF. </li></ol></li></ol> 4. Análise de componentes principais (PCA) <ol><li> Execute a análise de componentes principais inserindo a aba &quot;PCA&quot;. </li><li> Visualização dos principais componentes <ol><li> Alternar a caixa de seleção &quot;Mostrar PC Trajetória&quot; para visualizar os movimentos descritos pelos PCs com a ferramenta de visualização no navegador. </li><li> Certifique-se de que &quot;PrinCipal Component 1 &quot;é escolhido no primeiro menu suspenso. </li><li> Para visualizar os movimentos descritos por outros PCs, escolha o PC desejado no menu suspenso &quot;Escolher componente principal&quot;. </li><li> Altere a coloração da trajetória no menu suspenso &quot;Opções de cor&quot;. </li><li> Escolha &quot;Variabilidade por posição&quot; das &quot;Opções de cor&quot; para colorir por magnitude de deslocamento. </li><li> Clique no botão &quot;Download PDB trajectory&quot; no painel &quot;Visualização de Componentes Principais&quot; para obter uma visão de trajetória do movimento descrito pelos PCs. </li><li> Clique no botão &quot;Baixar PyMOL&quot; arquivo de sessão para gerar um arquivo de sessão PyMOL dando os movimentos como um campo vetorial. </li></ol></li><li> Análise de conformidade <ol><li> Projectar as estruturas individuais em dois PCs selecionados, clicando no botão azul &quot;Próximo&quot; (Plot). </li><li> Certifique-se de que &quot;PC no eixo X&quot; esteja configurado para 1, e &quot;PC oN Y-axis &quot;para 2. Para projetar as estruturas em outros PCs, ajuste a numeração do PC de acordo. </li><li> Escolha &quot;Cluster by PC Subspace&quot; para colorir as estruturas no gráfico por cluster baseado em PC; &quot;RMSD&quot; para corar por agrupamento baseado em &quot;RMSD&quot;; E &quot;Sequência&quot; para colorir por agrupamento baseado em seqüência. </li><li> Clique em qualquer ponto individual no gráfico para rotular as estruturas. Alternativamente, destaque uma ou mais estruturas na tabela &quot;anotação PCA conformer plot&quot; abaixo do enredo. </li><li> Deslize os PCs no controle deslizante subespaço para incluir PCs mais / menos para o algoritmo de agrupamento. </li></ol></li><li> Contribuições de resíduos <ol><li> Calcule as contribuições de resíduos para os PC individuais, clicando no botão azul &quot;Próximo&quot; (Contribuições de resíduos). </li><li> Trace as contribuições para computadores adicionais, incluindo o número do PC na caixa de texto &quot;Escolher componente principal&quot;. </li><li> Alternar o &quot;Spread liNes &quot;caixa de seleção evitar traçar as contribuições de resíduos em cima uns dos outros. </li><li> Desligue a caixa de seleção &quot;Multiline plot&quot; para traçar as contribuições de resíduos em lotes separados. </li><li> Alternar o &quot;Mostrar RMSF&quot; para incluir os valores RMSF (da guia FIT). </li></ol></li></ol> 5. Ensemble Normal Mode Analysis (eNMA) <ol><li> Clique na guia eNMA para iniciar o cálculo dos modos normais (NMs). </li><li> Estrutura do filtro <ol><li> Ajuste o número de estruturas reduzindo ou aumentando o &quot;Limite&quot; para inclusão / exclusão de estrutura. </li><li> Clique no verde &quot;Run Ensemble NMA&quot; para iniciar o cálculo NMA. </li></ol></li><li> Visualização de modos normais <ol><li> Desça até o segundo painel da guia eNMA (visualização de modos normais) para visualização dos NMs. NOTA: Por padrão, o NM com a maior sobreposição (similaridade) ao PC-1 é exibido no visualJanela de ização. </li><li> Para visualizar os movimentos descritos por outros NMs ou outras estruturas PDB, escolha o NM e a estrutura desejada nos menus suspensos &quot;Escolha Modo&quot; e &quot;Mostrar NMs para estrutura&quot; , respectivamente. </li></ol></li><li> Flutuações de resíduos <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (Flutuações) para calcular as flutuações de estrutura residual selecionadas para eNMA. </li><li> Alternar o &quot;Cluster by RMSD&quot; para colorir os perfis de flutuação por agrupamento baseado em RMSD. </li><li> Alternar o &quot;Cluster by RMSIP&quot; para colorir os perfis de flutuação por agrupamento baseado em RMSIP. </li><li> Alterna a caixa de seleção &quot;Linhas de propagação&quot; para traçar os perfis de flutuação agrupados, um para o outro. </li></ol></li><li> Comparando NMA e PCA <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (PCA-vs-NMA) para calcular a semelhança entre os NMs individuais e PCs. </li><li> Selecione um PDB ID no menu suspenso &quot;Compare NMs of structure&quot; para calcular a semelhança entre os NMs desta estrutura para os PCs calculados na guia PCA. </li></ol></li><li> Análise de sobreposição <ol><li> Clique no botão azul &quot;Próximo&quot; (análise de sobreposição) para calcular a sobreposição entre os NMs calculados e o vetor de diferença de estrutura entre duas estruturas selecionadas. </li><li> Selecione uma identificação de PDB &quot;referência&quot; no menu suspenso &quot;Comparar NMs of structure&quot; e ou um ou mais IDs de PDB na tabela de estrutura para a comparação pairwise com o PDB de referência. </li></ol></li><li> Análise de agrupamento <ol><li> Clique no botão azul &quot; Próximo&quot; (Clustering) para executar o agrupamento de estrutura com base na semelhança de NM em pares (RMSIP). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Bio3D-web pode ser usado para explorar e mapear os estados estruturais, dinâmicos e funcionais das proteínas das estruturas cristalográficas disponíveis. Além disso, os resultados de agrupamento baseados em NMA e PCA, juntamente com as anotações e análises baseadas em seqüências, podem ser particularmente úteis para selecionar estruturas representativas para análises mais demoradas, como simulações de pequena molécula de acoplamento ou dinâmica molecular. A Bio3D-web facilita análises de bioinformática estrutural avançada para uma gama mais ampla de pesquisadores, reduzindo o nível de conhecimento técnico exigido. O design atual da Bio3D-web enfatiza a simplicidade sobre a inclusão exaustiva dos muitos métodos de análise disponíveis no pacote Bio3D autônomo completo. Em muitos casos, prevê-se que os pesquisadores usem o Bio3D-web para entender as tendências gerais em sua família de proteínas ou superfamília de interesse, o que pode então informar análises mais especializadas. Bio3D-web é oAntes projetado para explorar rapidamente os conjuntos de dados da estrutura biomolécula e atuar como uma ferramenta geradora de hipóteses. Incentivamos os usuários a explorar seus dados fornecendo o exemplo de código Bio3D no relatório reprodutível que também armazena todos os detalhes da consulta e os resultados da análise. No exemplo representativo do exemplo acima, mostramos a capacidade da Bio3D-web para revelar as características estruturais das transições conformacionais funcionais da Adk. Aplicações adicionais do Bio3D-web incluem análise estrutural e dinâmica de estruturas PDB carregadas pelo usuário. Por exemplo, o usuário pode enviar novas estruturas ou mesmo seqüências de proteínas para análise. As etapas de análise mencionadas anteriormente, especialmente o passo de eNMA, podem revelar tendências locais e globais em movimentos de proteínas, com movimentos coletivos de significância funcional. A comparação com estruturas de apo também pode revelar características de transições conformacionais não ligadas a encadernadas. Exemplos adicionais de aplicação paraUma variedade de diferentes famílias de proteínas são fornecidas online. Embora todas as proteínas sejam entidades flexíveis e dinâmicas, nem todas as proteínas possuem estruturas de resolução atômica disponíveis em uma variedade de estados diferentes ( por exemplo, estados ativos e inativos). Nossa visão do espaço da estrutura protéica é, portanto, limitada e, portanto, a visão obtida de ferramentas como a Bio3D-web também é necessariamente limitada para certas proteínas. No entanto, com os avanços tecnológicos atuais e as novas iniciativas para a genômica estrutural, o protocolo aqui apresentado se tornará cada vez mais um caminho importante para obter informações sobre relacionamentos estrutura-função importantes. Um passo crítico, que é particularmente importante ao analisar proteínas mais distantes, é o potencial surgimento de erros de alinhamento na guia ALIGN. Os erros de alinhamento inevitavelmente ocorrerão quando a semelhança da sequência cair abaixo de 30% e o usuário deve, nesses casos, verificar e corrigir o alinhamento da sequênciaNa guia ALIGN. Erros de alinhamento, possivelmente, resultarão em estruturas superpostas impostas na guia FIT e mascararão as variações conformacionais mais relevantes para o PCA subsequente. Além disso, o usuário deve estar ciente dos resíduos em falta nas estruturas de PDB selecionadas, como na implementação atual PCA só pode ser realizada em resíduos de proteína em que todas as estruturas têm o seu átomo de carbono alfa correspondente resolvido. Conseqüentemente, se um PDB selecionado tiver resíduos não resolvidos para uma região específica da proteína, esta região será omitida da PCA. O Bio3D-web atualmente está limitado à análise de estruturas de PDB de cadeia única. Consequentemente, os movimentos funcionais que ocorrem no nível quaternário não podem ser explorados usando o protocolo atual. Embora atualmente estejamos desenvolvendo novos algoritmos para incluir essa análise no Bio3D-web, a única opção atual é através do uso convencional de Bio3D. Bio3D-web é o único aplicativo onlineQue permite pesquisar e identificar conjuntos de estruturas, interpretar seus padrões de seqüência e variabilidade estrutural e extrair informações mecanicistas tanto da análise quanto da predição de sua plasticidade estrutural. Uma ampla gama de ferramentas de visualização molecular e servidores on-line permitem aos pesquisadores explorar e analisar estruturas biomoleculares individuais. No entanto, as ferramentas existentes para análise da seqüência, estrutura e dinâmica de grandes famílias de proteínas heterogêneas muitas vezes requerem conhecimentos computacionais significativos e, tipicamente, permanecem acessíveis apenas para usuários com habilidades de programação relevantes. Por exemplo, o pacote Bio3D requer R 8 , o ProDy requer python e Maven requer conhecimento 9 , 10 de Matlab. A Bio3D-web, em contraste, não requer conhecimento de programação e, assim, aumenta a acessibilidade e diminui a barreira de entrada para realizar uma seqüência comparativa avançada, estrutura e dyAnálise de namics. Além disso, a preparação, a cura, a anotação e a limpeza das estruturas moleculares que são freqüentemente necessárias para análises eficientes estão incluídas no serviço web Bio3D. Além disso, a restrição para realizar essa análise em recursos computacionais capazes é aliviada por nossa instância de servidor que permite a análise em grande escala de muitas estruturas que podem ser iniciadas e controladas a partir de qualquer navegador web moderno. O desenvolvimento aberto do Bio3D-web está em andamento (consulte https://bitbucket.org/Grantlab/bio3d). Continuamos a adicionar novas funcionalidades de análise e a melhorar os métodos existentes. O desenvolvimento futuro incidirá na adição de PCA baseado em matriz de distância e PCA torsional, abordagens de conservação de seqüência mais extensas que incluam um componente filogenético, identificação de local de ligação de conjunto e novas abordagens para análise de rede dinâmica em famílias de proteínas. A este respeito, a aplicação web atual representa o ponto inicialT para muitos outros fluxos de trabalho de análise de bioinformática estrutural colaborativa, permitindo etapas reproduzíveis e compartilháveis ​​em conjuntos de estrutura experimental definidos pelo usuário. Também planejamos o suporte futuro de conjuntos de coordenadas de unidades biológicas reconstruídas, além de cadeias individuais e múltiplas da unidade assimétrica de estruturas PDB. Recursos adicionais incluirão poupança e carregamento aprimorados de espaços de trabalho colaborativos, juntamente com uma possibilidade de desfazer. Bio3D-web é um aplicativo on-line para análise interativa de dados de estrutura biomolecular. O Bio3D-web é executado em qualquer navegador da Web moderno e fornece funcionalidade para: (1) A identificação de conjuntos de estrutura de proteína relacionados aos limites específicos de similaridade do usuário; (2) Seu alinhamento múltiplo e estrutura superposição; (3) Análise de conservação de seqüência e estrutura; (4) Mapeamento de relacionamento entre confórmeros com análise de componente principal, e (5) comparação de dinâmicas internas previstas por conjunto nemAnálise de modo mal. Esta funcionalidade integrada fornece um fluxo de trabalho completo para a investigação de relacionamentos estrutura-estrutura-sequência dentro de famílias de proteínas e superfamílias. Além de uma interface dinâmica fácil de usar para explorar os efeitos das opções de parâmetros e métodos, o Bio3D-web também grava a entrada completa do usuário e os resultados gráficos subsequentes da sessão de um usuário. Isso permite aos usuários compartilhar e reproduzir facilmente a seqüência de etapas de análise que criaram seus resultados. O Bio3D-web é implementado inteiramente no idioma R e é baseado nos pacotes Bio3D e Shiny R. Pode ser executado a partir do nosso servidor on-line ou instalado localmente em qualquer computador rodando R. Isso inclui a instalação do servidor local para fornecer uma instância multiusuficiente personalizada com acesso a conjuntos de dados estruturais prioritários, como os comuns na indústria farmacêutica. O código fonte completo ea extensa documentação são fornecidos sob uma licença de código aberto GPL-3 de: http://thegrantlab.org/ Bio3d / webapps

O banco de dados de proteína (PDB) agora contém mais de 120.000 estruturas de proteína - muitas das quais são da mesma família de proteínas, mas resolvidas em diferentes condições experimentais. Essas múltiplas estruturas representam um recurso inestimável para entender as complexidades da forma e função da proteína. Por exemplo, a comparação rigorosa desses conjuntos estruturais pode revelar importantes mecanismos moleculares 1 , 2 , 3 e informar sobre dinâmicas conformacionais envolvidas em processos, incluindo ligação de ligando, catálise enzimática e reconhecimento bi-molecular 4 , 5 , 6 , 7 . Novos insights podem ser obtidos com a análise detalhada em larga escala da sequência, estrutura e dinâmica das famílias de proteínas. No entanto, isso normalmente requer bioinfia considerávelConhecimentos de programação ormática e informática, juntamente com a familiaridade com os sistemas de proteínas em estudo. Por exemplo, pacotes de software como Bio3D, ProDy e Maven requerem programação em R, Python e Matlab, respectivamente 8 , 9 , 10 . Por outro lado, as ferramentas on-line para análise de flexibilidade estrutural são geralmente limitadas à investigação de estruturas individuais 11 , 12 . Uma excepção a este respeito é o servidor WebNM @ recentemente desenvolvido, que permite a comparação de padrões de flexibilidade obtidos da análise de modo normal (NMA) de várias estruturas pré-alinhadas especificadas pelo usuário 13 . No entanto, este servidor não possui um procedimento automatizado para a identificação de estruturas para comparação, seu alinhamento ou análise posterior além da NMA. Outra contribuição recente é o banco de dados PDBFlex on-line, que apresenta pré-cAnálise computorizada de estruturas PDB compartilhando identidade de sequência de 95% ou superior 14 . No entanto, a análise de conjuntos de estruturas mais diversas não está disponível no momento. Nós já apresentamos o Bio3D-web - um aplicativo web fácil de usar para a análise das relações de estrutura-estrutura-estrutura-dinâmica 15 . O Bio3D-web é único no fornecimento de funcionalidade integrada fácil de usar para a identificação, comparação e análise detalhada de grandes conjuntos de estruturas homólogas online. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a investigação on-line da relação proteína-sequência-estrutura-dinâmica usando Bio3D-web. O Bio3D-web fornece uma variedade de funções para suportar os cinco principais passos da análise de dados mostrados na Figura 1 e discutidos em detalhes abaixo. Essas etapas constituem um fluxo de trabalho que abrange a seqüência de consulta ou a entrada da estrutura, através de vários níveis de análise de seqüência-estrutura-dinâmica, para resumirE geração de relatórios. Os resultados estão disponíveis imediatamente através de extensas aplicações de visualização e planejamento no navegador, bem como através do download de arquivos de resultados em formatos comumente usados. Além de uma interface dinâmica fácil de usar para explorar os efeitos das opções de parâmetros e métodos, a Bio3D-web também registra a entrada completa do usuário e os resultados gráficos subseqüentes da sessão de um usuário como um relatório reproduzível compartilhável em formatos PDF, DOC e HTML. As sessões do usuário podem ser salvas e recarregadas em tempos futuros e resultados completos baixados e interpretados pelo pacote Bio3D R na máquina local de um usuário. A Bio3D-web é alimentada pelo pacote Bio3D R para análise de dados de simulação biológica, sequência e simulação biomolecular 8 , 16 . Em particular, algoritmos Bio3D para identificação de núcleo rígido 8 , superposição, análise de componentes principais(PCA) 8 e a análise de modo normal de conjunto (eNMA) 16 formam a base da aplicação. Também utilizamos protocolos Bio3D que dependem do pHMMER 17 para identificação de estruturas protéicas relacionadas e MUSCLE 18 para alinhamento de sequências múltiplas. As anotações de estrutura e sequência são derivadas através de utilitários Bio3D a partir dos bancos de dados RCSB PDB 19 e PFAM 20 . O Bio3D-web pode ser executado a partir de nosso servidor on-line ou instalado localmente em qualquer computador que esteja executando o R. Bio3D-web está aberto a todos os usuários e é fornecido gratuitamente sob uma licença de código aberto GPL-3 de: http: // thegrantlab. Org / bio3d / webapps

<table><tbody><tr><td>Bio3D-web</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Web-site</td><td>http://thegrantlab.org/bio3d-web/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Requirements</td><td>Web browser</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating protein sequence-structure-dynamics relationships with bio3d-web

Demonstamos o uso da Bio3D-web para análise interativa de dados de estrutura biomolecular. O aplicativo Bio3D-web oferece funcionalidade on-line para: (1) A identificação de conjuntos de estruturas protéicas relacionadas aos limites de similaridade especificados pelo usuário; (2) Seu alinhamento múltiplo e estrutura superposição; (3) Análise de conservação de seqüência e estrutura; (4) Mapeamento de relacionamento entre confórmeros com análise de componentes principais e (5) comparação de dinâmicas internas previstas através de análise de modo normal de conjunto. Essa funcionalidade integrada fornece um fluxo de trabalho completo em linha para investigar relacionamentos estrutura-estrutura-estrutura dentro de famílias de proteínas e superfamílias.

Adenylate kinase (Adk) é uma enzima ubíqua que funciona para manter o equilíbrio entre nucleotídeos citoplasmáticos essenciais para muitos processos celulares. O Adk opera catalisando a transferência reversível de um grupo fosforil de ATP para AMP. Essa reação é acompanhada por transições conformacionais limitantes de taxa bem estudadas 3 , 21 . Aqui, analisamos todas as estruturas Adk atualmente disponíveis com Bio3D-web para revelar características detalhadas e princípios mecanicistas dessas transições essenciais. Podemos começar a análise Bio3D-web da Adk digitando o código RCSB PDB de qualquer estrutura Adk conhecida. Por exemplo, inserir o PDB ID 1AKE no painel A da guia SEARCH retorna 167 estruturas semelhantes a seqüências das quais os top 26 são selecionados automaticamente para análise posterior (veja o painel B). A anotação presenteEd no painel C indica que essas estruturas selecionadas são todas de E. coli, foram resolvidas por difração de raios X em uma gama de grupos espaciais; Têm uma gama de resolução de 1,63 a 2,8 Â e foram co-cristalizados com uma gama de diferentes ligandos (incluindo não ligandos, AMP, ADP, MG e o inibidor AP5). Observe que os detalhes de anotação adicionais podem ser exibidos clicando na opção &quot;Mostrar / Ocultar Colunas&quot; no painel C. O alinhamento de seqüência múltipla é realizado ao entrar na guia ALIGN. O primeiro painel da guia ALIGN exibe um resumo do alinhamento que fornece detalhes sobre o número de linhas de seqüência (equivalente ao número de estruturas PDB), bem como o número de posições ( ou seja , colunas de alinhamento). Isso inclui uma especificação do número de colunas que não possuem espaços e lacunas. A figura no lado direito da primeira linha fornece uma representação esquemática do alinhamento da seqüência. Aqui thAs áreas cinzentas representam posições não gap, enquanto as áreas brancas no alinhamento correspondem a lacunas. Uma representação da conservação da sequência é mostrada acima do alinhamento com áreas vermelhas indicando posições bem conservadas e branco indicando menos conservado. Observe que as seqüências nesta figura são ordenadas com base em sua similaridade fornecida pelo dendrograma de agrupamento no lado esquerdo. O segundo painel desta guia facilita ainda o agrupamento dos PDBs selecionados com base em sua similaridade de seqüência em pares, que pode ser visualizado como um dendrograma ou um mapa de calor. Por padrão, é mostrado um dendrograma (ou diagrama de árvore) que representa a disposição dos clusters. O eixo y do dendrograma representa a distância (em termos de identidade de sequência) entre os clusters. A superposição da estrutura é realizada automaticamente ao entrar na guia FIT. As estruturas sobrepostas, exibidas de forma interativa no painel A, indicaNa presença de uma região do núcleo relativamente rígida (abrangendo os resíduos 1-29, 68-117 e 161-214, veja o painel &quot;detalhes do núcleo opcional e detalhes do RMSD&quot; na parte inferior da guia FIT para obter detalhes). Duas outras regiões variáveis ​​de ligação a nucleótidos (resíduos 30-67 e 118-167) também são claramente visíveis ( Figura 2 ). O agrupamento baseado em RMSD agrupa essas estruturas em duas conformações distintas. Clicar na guia PCA mostra mais claramente a relação entre as estruturas em termos de deslocamentos dessas regiões que efetivamente se fecham sobre as espécies nucleotídicas ligadas em estruturas relacionadas ( Figura 2B e 2C ). A maioria das estruturas está na forma &quot;fechada&quot; (azul na Figura 2C ) e está associada a um ligando ou inibidor ligado. Em contraste, as conformações mais abertas são livres de inibidores de nucleótidos e inibidores. Isso é consistente comO vasto conjunto de pesquisas sobre a estrutura e a dinâmica de Adk, indicando que uma configuração aberta dessas regiões é necessária para a ligação de nucleotídeos e uma conformação fechada para transferência eficiente de fosforil e supressão de eventos de hidrólise prejudicial. É notável que um único PC capture 97% do deslocamento quadrático médio total neste conjunto de estruturas Adk e fornece uma descrição clara e convincente da transição aberta para fechada junto com as contribuições de resíduos individuais para esse deslocamento funcional (painel C do aplicativo E Figura 2 ). A visita da guia NMA e o aumento do número de estruturas consideradas para o cálculo (através da redução do ponto de corte para filtragem de estruturas semelhantes) indicam que as estruturas de estado aberto exibem dinâmicas locais e globais aprimoradas em comparação com as estruturas de formas fechadas ( Figura 2D e painel C do aplicativo) . Comparando PCA e NMA resultados paraEstruturas individuais (painel D) indicam que o primeiro modo de todas as estruturas abertas exibe uma sobreposição relativamente alta para o PC1 (com um valor médio de 0,37 ± 0,04). Em contraste, as estruturas de formas fechadas apresentam valores mais baixos (com uma média de 0,30 ± 0,01). Os valores de RMSIP para estruturas abertas (0,62 ± 0,003) também são superiores aos de estruturas fechadas (0,56 ± 0,008). Além disso, a análise de sobreposição mostra que os primeiros modos do estado aberto estão de acordo com a mudança conformacional que descreve a diferença dos estados aberto e fechado (painel E). O agrupamento baseado em valores do RMSIP novamente exibe uma partição consistente de estruturas de estado aberto e fechado (painel F). Coletivamente, esses resultados indicam a existência de dois estados conformacionais distintos para Adk. Estes diferem por um deslocamento coletivo de baixa freqüência de duas regiões do site de ligação a nucleótidos que exibem flexibi distintoLidades após a ligação de nucleótidos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral da Bio3D-web com capturas de tela das guias PCA e NMA. A Bio3D-web possui uma estrutura ou seqüência de proteína fornecida pelo usuário como entrada na guia SEARCH ( 1 ). O servidor fornece uma lista de estruturas relacionadas, que podem ser selecionadas para análise posterior. ( 2 ) A guia ALIGN fornece alinhamento de seqüência e análise das estruturas selecionadas na guia SEARCH. ( 3 ) Na guia FIT, todas as estruturas são sobrepostas e visualizadas em 3D, juntamente com os resultados da análise convencional da estrutura par-wise. ( 4 ) A análise do componente principal do conjunto de estrutura é realizada na aba PCA para caracterizar as relações entre confeitárias. ( 5 ) A análise do modo normal em cada estrutura pode ser realizada na guia eNMAPara explorar tendências dinâmicas para os estados estruturais disponíveis. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55640/55640fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig2.jpg" /> Figura 2: Resultados da análise Bio3D-web da adenilato quinase. ( A ) Estruturas PDB disponíveis de adenilato cinase sobrepostas no núcleo invariante identificado. As estruturas são coloridas de acordo com o agrupamento baseado em RMSD fornecido na guia FIT. ( B ) A visualização dos principais componentes está disponível na guia PCA para caracterizar as principais variações conformacionais no conjunto de dados. Aqui, a trajetória correspondente ao primeiro componente principal é mostrada na representação do tubo mostrando o movimento de fechamento em larga escala da proteína. ( C ) Estruturas são prOjected em seus dois primeiros componentes principais em um gráfico de conformer mostrando uma representação de baixa dimensão da variabilidade conformacional. Cada ponto (ou estrutura) é colorido de acordo com critérios especificados pelo usuário, neste caso, resultados de agrupamento baseados em PCA. ( D ) A análise de modo normal na guia eNMA sugere dinâmicas locais e globais aprimoradas para estruturas em aberto (vermelho) em comparação com as estruturas de forma fechada (azul). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55640/55640fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

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Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

É apresentado um protocolo para a investigação on-line sobre a relação proteína-estrutura-dinâmica usando Bio3D-web.

Investigando a Seqüência de Proteínas - Estrutura-dinâmica Relacionamentos com Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

investigating-protein-sequence-structure-dynamics-relationships-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.4K visualizações.  University of Michigan Medical School.  É apresentado um protocolo para a investigação on-line sobre a relação proteína-estrutura-dinâmica usando Bio3D-web. 

Vídeo: Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Imunologia e Infecção

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional units (e.g., domains). Traditional consensus-building models fail to account for interpositional dependencies &#8211; functionally required covariation of residues that tend to appear simultaneously throughout evolution and across the phylogentic tree. These relationships can reveal important clues about the processes of protein folding, thermostability, and the formation of functional sites, which in turn can be used to inform the engineering of synthetic proteins. Unfortunately, these relationships essentially form sub-motifs which cannot be predicted by simple &#8220;majority rule&#8221; or even HMM-based consensus models, and the result can be a biologically invalid &#8220;consensus&#8221; which is not only never seen in nature but is less viable than any extant protein. We have developed a visual analytics tool, StickWRLD, which creates an interactive 3D representation of a protein alignment and clearly displays covarying residues. The user has the ability to pan and zoom, as well as dynamically change the statistical threshold underlying the identification of covariants. StickWRLD has previously been successfully used to identify functionally-required covarying residues in proteins such as Adenylate Kinase and in DNA sequences such as endonuclease target sites.

Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.

Otimização de proteínas sintéticas: Identificação de interposição Dependências Indicating Estruturalmente e / ou resíduos funcionalmente ligadas

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Química

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Bioquímica

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

Biomolecular visualization skills are paramount to understanding key concepts in the biological sciences, such as structure-function relationships and molecular interactions. Various programs allow a learner to manipulate 3D structures, and biomolecular modeling promotes active learning, builds computational skills, and bridges the gap between two dimensional textbook images and the three dimensions of life. A critical skill in this area is to model a protein active site, displaying parts of the macromolecule that can interact with a small molecule, or ligand, in a way that shows binding interactions. In this protocol, we describe this process using four freely available macromolecular modeling programs: iCn3D, Jmol/JSmol, PyMOL, and UCSF ChimeraX. This guide is intended for students seeking to learn the basics of a specific program, as well as instructors incorporating biomolecular modeling into their curriculum. The protocol enables the user to model an active site using a specific visualization program, or to sample several of the free programs available. The model chosen for this protocol is human glucokinase, an isoform of the enzyme hexokinase, which catalyzes the first step of glycolysis. The enzyme is bound to one of its substrates, as well as a non-reactive substrate analog, which allows the user to analyze interactions in the catalytic complex.

A key skill in biomolecular modeling is displaying and annotating active sites in proteins. This technique is demonstrated using four popular free programs for macromolecular visualization: iCn3D, Jmol, PyMOL, and UCSF ChimeraX.

Modelando um site ativo enzimático usando freeware de visualização molecular

Biomolecular visualization skills are paramount to understanding key concepts in the biological sciences, such as structure-function relationships and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Prevendo preferências de aminoácidos de interfaces de ligação proteína-proteína

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: uma abordagem computacional para decifrar preferências de aminoácidos em interações proteína-proteína multiespecíficas

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

Predição computacional de preferências de aminoácidos de domínios de ligação peptídica potencialmente multiespecíficos envolvidos em interações proteína-proteína

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

Um protocolo para Computer-Based Estrutura de Proteínas e de Previsão de Função

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Biologia

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Investigando a Seqüência de Proteínas - Estrutura-dinâmica Relacionamentos com Bio3D-web

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